【摘要】 ［目的］ 探讨乳腺癌组织中runx3、cyclin d1和p27kip1基因的表达及其临床意义。［方法］ 采用免疫组织化学sp法检测88例乳腺癌、40例乳腺纤维腺瘤、40例乳腺增生病中runx3、cyclin d1和p27kip1的表达。［结果］ （1）runx3和p27kip1在乳腺癌中的阳性表达率分别为35.23%和51.14%，明显低于在乳腺纤维腺瘤(85%和82.5%)及乳腺增生病(87.5%和85%)中的表达率（p<0.05）。乳腺癌中cyclin d1的表达率（63.63%）明显高于良性病变中表达。（2）runx3 和p27kip1蛋白表达与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移呈负相关，p27kip1蛋白表达与病理分级呈负相关。cyclin d1蛋白表达与病理分级呈正相关。（3）乳腺癌中runx3与p27kip1蛋白的表达呈正相关性（p<0.05），与cyclin d1的表达呈负相关性（p>0.05）。［结论］ runx3、cyclin d1和p27kip1在乳腺癌的发生发展中起重要作用。检测乳腺癌组织中runx3、cyclin d1和p27kip1基因的表达对于评价患者的预后有一定价值。
【关键词】 乳腺肿瘤
expressions of runx3, cyclin d1 and p27kip1 in breast cancer and their significance
jiang ying1, tong dan-dan2, zhang ying1
( second affiliated hospital of harbin medical university, harbin 150086, china;
medical university, harbin 150086, china)
abstract： ［purpose］ to investigate the expressions of runx3, cyclin d1 and p27kip1 in breast cancer and their significance. ［methods］ expressions of runx3, cyclin d1 and p27kip1 in 88 cases with breast cancer, 40 cases with breast fibroadenoma and 40 cases with mazoplasia were detected by immunohistochemical sp method. ［results］ (1)the positive expression of runx3 and p27kip1 in breast cancer was 35.23% and 51.14% respectively. they were significantly lower than those in breast fibroadenoma (85% and 82.5%) and mazoplasia (87.5% and 85%)(p<0.05).the positive expression of cyclin d1 in breast cancer (63.63%) was significantly higher than that in the benign tissues (p<0.05). (2)the positive expression of runx3 and p27kip1 in breast cancer was negatively correlated to the clinical staging or node metastasis（p<0.05）. the expression of p27kip1 was negatively correlated to the histologic grade, but cyclin d1 expression showed positive correlation with histologic grade（p<0.05）. (3) the expression of runx3 was positively correlated with the expression of p27kip1, and negatively correlated with cyclin d1. ［conclusion］ runx3, cyclin d1 and p27kip1 may play an important role in the carcinogenesis and progression of breast cancer. the detection of runx3, cyclin d1 and p27kip1 protein expression has a definite value in evaluating prognosis for breast cancer.
key words: breast neoplasms; runx3; cyclin d1; p27kip1; immunohistochemistry
runx3基因是最近研究发现的一个抑癌基因，定位于人类染色体1p36.1区域[1]，参与许多肿瘤的发生过程，其在人乳腺癌中的表达及其与cyclin d1和p27kip1表达的相关性少见报道。我们应用免疫组化的方法检测runx3蛋白在乳腺癌中的表达情况，分析其与临床病理参数的关系，以及与抑癌基因p27kip1和癌基因cyclin d1蛋白表达的相关性，分析runx3基因在乳腺癌中的作用及其与其他肿瘤相关基因之间的关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集哈尔滨医科大学附属第二医院病理科1997~1998年乳腺手术标本168例，其中乳腺癌88例、乳腺纤维腺瘤40例、乳腺增生病40例。乳腺癌患者年龄27~83岁，中位年龄52岁。原位癌18例，浸润性癌70例。其中导管癌57例(导管原位癌11例，浸润性导管癌46例)，小叶癌31例（小叶原位癌7例，浸润性小叶癌24例）。临床分期：ⅰ~ⅱ期52例，ⅲ~ⅳ期36例。
1.2 免疫组化方法
采用免疫组织化学sp法，即链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶法检测乳腺癌组织中runx3蛋白的表达。实验步骤按说明书进行。浓缩型runx3兔抗人多克隆抗体购自active motif公司，鼠抗人cyclin d1、p27kip1单克隆抗体、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗及dab试剂均购自福州迈新生物技术公司。采用pbs液代替一抗作为阴性对照，采用已知的阳性片作为阳性对照。
1.3 结果判定标准
runx3蛋白在乳腺癌、乳腺纤维腺瘤及乳腺增生病中的阳性表达为细胞核阳性，呈棕黄色，阳性细胞数>10%为阳性表达，细胞浆及细胞膜染色为阴性[2]。cyclin d1、p27kip1蛋白的阳性染色为棕黄色颗粒，位于细胞核，阳性细胞数>10%为阳性表达，否则为阴性。
1.4 统计学方法
数据统计分析采用χ2检验。
2 结 果
2.1 runx3、cyclin d1、p27kip1蛋白在乳腺癌及良性乳腺病中的表达
runx3阳性信号位于细胞核中，呈棕黄色颗粒分布。乳腺纤维腺瘤及乳腺增生病中runx3表达皆位于细胞核，而在部分乳腺癌中出现细胞浆棕色颗粒，判定为阴性。cyclin d1、p27kip1蛋白的阳性信号定位于细胞核，呈棕黄色细颗粒。乳腺癌组织中runx3和p27kip1蛋白的表达明显低于乳腺纤维腺瘤及乳腺增生病组织，差异有统计学意义（p<0.05），cyclin d1蛋白的表达明显高于乳腺纤维腺瘤和乳腺增生病组织，差异有统计学意义（p<0.05）。三种蛋白在乳腺纤维腺瘤及乳腺增生病组织中的表达差异无统计学意义。见表１。
2.2 runx3、cyclin d1、p27kip1蛋白表达与乳腺癌临床病理参数的关系
乳腺癌中runx3、p27kip1蛋白的阳性表达率随着临床分期的增高而逐渐降低，各组间差异有显著性（p<0.05）。无淋巴结转移组中的runx3、p27kip1蛋白的阳性表达率明显高于有淋巴结转移组。p27kip1蛋白的阳性表达率随着病理分级的增高而降低，差异有统计学意义（p<0.05）。随着组织学分级的增高，cyclin d1蛋白的阳性表达率逐渐增高（p<0.05）。浸润性癌中runx3的表达明显降低, cyclin d1表达明显增高，差异有统计学意义。runx3、cyclin d1、p27kip1蛋白的表达与患者的年龄和肿瘤类型等参数无显著性相关。见表2。
2.3 runx3、cyclin d1、p27kip1蛋白之间表达的关系
乳腺癌中runx3与p27kip1蛋白的表达呈显著性正相关（p<0.05），与 cyclin d1的表达呈显著性负相关（p>0.05）。见表3。
3 讨 论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，它的发生发展是多基因多因素共同作用的结果。runx3基因是levanon等[3]于1994年发现的，最初被命名为急性髓性白血病2基因，以后又被称作多瘤病毒强化因子结合蛋白2基因、核心结合因子α3基因，位于人染色体1号短臂1 p36.１上，含有6个外显子，总长约为67kb。li等[4]2002年研究发现敲除runx3基因的小鼠胃黏膜上皮细胞对转化生长因子-β(transforming growth factor beta，tgfβ)所诱导的生长抑制和凋亡作用缺乏反应，提示runx3基因可能是tgf-β信号作用的靶点。runx3基因可能作为tgf-β传导通路中的一个重要环节，参与tgf-β对上皮细胞生长的负调控作用。最近研究显示，runx3基因作为一个抑癌基因，具有诱发细胞凋亡，调节细胞周期的功能。lau等[5]的研究发现runx3基因在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中存在低表达，在乳腺癌中runx3基因可能通过启动子区域甲基化和蛋白质的异位表达双重作用参与肿瘤的发生过程。
本研究中runx3蛋白在乳腺癌组织中表达明显下降，提示runx3基因的表达失活可能与乳腺癌的发生相关。runx3基因表达与乳腺癌患者的临床分期密切相关，即随着乳腺癌的进展，runx3表达率降低；有淋巴结转移的病例runx3表达降低，这提示runx3基因可能不仅与乳腺癌的发生相关，而且与乳腺癌的进展也密切相关，影响患者的预后。同时我们发现乳腺纤维腺瘤和乳腺增生病中runx3的阳性表达部位皆位于细胞核，而在乳腺癌中部分病例出现明显的细胞浆着色，细胞核为阴性。这表明runx3基因失活时runx3蛋白的表达可由细胞核迁入细胞浆，但具体发生机制尚待进一步研究。
目前的研究已证明，癌基因的致癌作用以及抑癌基因的抑癌作用是多个基因共同作用的结果。cyclin d1是一种细胞周期蛋白，在控制细胞分裂由g1期向s期转变过程中起着非常重要的作用。动物实验结果表明，cyclin d1过表达可导致转基因鼠发生乳腺癌，说明cyclin d1基因是导致乳腺上皮细胞恶性变的癌基因[6]。本研究表明，乳腺癌中存在cyclin d1的过表达，且分化越差的癌组织中cyclin d1阳性表达率越高，但它的表达与患者的年龄、肿瘤类型、临床分期和淋巴结转移无关，说明cyclin d1的异常表达可能是乳腺癌发生的早期事件，但与肿瘤的进展无关。p27kip1基因定位于12p13，它的表达产物p27kip1蛋白是细胞周期的负调控因子，通过抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶来抑制细胞周期，阻止肿瘤的形成[7]。本组资料表明，乳腺癌中存在明显的p27kip1蛋白低表达，且随着病理分级和临床分期的增高，表达明显降低，提示p27kip1蛋白的表达降低与乳腺癌的发生相关，且p27kip1蛋白高表达与好的生物学行为有关。
本研究中runx3的表达与cyclin d1的表达呈负相关，与p27kip1的表达呈正相关，说明cyclin d1、p27kip1基因可能作为runx3基因作用途径中的相关基因，相互作用共同参与乳腺癌的发生过程。但runx3基因与cyclin d1、p27kip1基因的相互作用机制尚待进一步研究。
【参考文献】
[1] levanon d, bettoun d, harris-cerruti c, et runx3 transcription factor regulates development and survival of trkc dorsal root ganglia neurons[j]. embo j, 2002, 21（13）:3454-3463.
[2] kosei ito, qiang liu, manuel st, et al. runx3, a novel tumor suppressor, is frequently inactivated in gastric cancer by protein mislocalization[j]. cancer res, 2005, 65(17):7743-7750.
[3] levanon d, negreanu v, bernstein y, et al. aml1, aml2 and aml3, the human members of the runt domain gene-family: cdna structure, expression and chromosomal localization[j]. genomics, 1994, 23（2）:425-432.
[4] li ql, ito k, sakakura c, et al. causal relationship between the loss of runx3 expression and gastric cancer[j]. cell, 2002, 109(1):113-124.
[5] lau qc,raja e, salto-tellez m, et al. runx3 is frequently inactivated by dual mechanisms of protein mislocalization and promoter hypermethylation in breast cancer[j]. cancer res, 2006, 66(13):6512-6520.
[6] sutherland rl, musgrove ea. cyclin d1 and mammary carcinoma: new insights from transgenic mouse models[j]. breast cancer res, 2002, 4(1):14-17.
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