白三烯受体拮抗剂图片(半胱氨酸白三烯受体拮抗剂)

中国论文网 发表于2022-11-10 15:23:00 归属于医疗卫生 本文已影响126 我要投稿 手机版

       中国论文网为大家解读本文的相关内容:          

  半胱氨酰白三烯受体包括CysLTkCysLT2和GPR17三种亚型其中,对CysLT受体了解得较多,且有较多选择性拮抗剂,而对CysLT2受体相对了解得较少[㈩;GPR17为新近鉴定的亚型,有待深入研究CysLT2受体分布在脉脾脏、淋巴结、脑、肾脏小肠皮肤脐静脉内皮细胞、支气管和冠脉平滑肌细胞血液单核细胞和巨噬细胞、肥大细胞等;其效应包括激活血管内皮细胞和巨噬细胞促进肥大细胞释放IL~8等细胞因子、促进肺纤维化等。本实验室最近发现,CysLT2受体介导星形胶质细胞缺血损伤;并且,发现大鼠胶质瘤C6细胞主要表达CysLT2受体这些结果为进一步研究该受体亚型的调节作用奠定了基础。


  但是,有两个因素限制CysLT2受体研究的深入,一是缺乏选择性拮抗剂,二是缺乏对动物的特异性抗体,仅有针对人的商品化抗体。为此,除了筛选CysLT2受体拮抗剂外,本研究在制备另一种CysLT受体GPR17抗体的基础上[8],制备兔抗大鼠CysLT2受体抗体,并研究其在Westernblot和免疫组化方面的应用。


  1材料和方法


  1.1试剂及仪器钉形贝血蓝蛋白(keyhole-limpethemocyanin,KLH)偶联的CysLT2受体鼠),委托上海吉尔生化有限公司合成;弗氏完全、不完全佐剂购自Sgma公司;HRP标记的羊抗兔IgG,购自联科生物;抗人CysLT2受体抗体,购自美国Cayman化学公司;小鼠抗神经核(neuronalnuclei,NeuN,神经兀标记物)抗体抗胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP,星形胶质细胞标记物)异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG及Cy3标记的山羊抗小鼠IgG,购自美国Chemicon公司多波长酶标仪(Elx800UniversalMicro?plateRecorder,美国Bio-TEK公司);SDS-PAGE胶电泳转膜装置(美国BIO-RAD公司);ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统(美国LI~CORBiosciences公司);冰冻切片机(CM1900,德国Leica公司);荧光显微镜(BX51,日本Olympus公司)


  1.2实验动物雄性家兔3只,体重25~3kg,购自浙江大学动物中心;成年雄性昆明种小鼠和SD大鼠各5只,购自浙江省医学科学院试验动物中心(合格证号:2008^0033)


  1.3CysLT2受体多克隆抗体制备KLH-CysLT2受体多肽抗原以生理盐水稀释成2mg/ml,与等体积的弗氏佐剂以三通管推注法乳化30min,将少量乳化剂滴入冷水中,若保持完整不分散,呈滴状浮于水面,即乳化完全,可用于家兔免疫。


  多肽(cg)FAGENFKARLRAIFSKDHL(大在家兔背部脊柱两侧、颈部皮肤’多点皮下


  注射乳化抗原共1ml只。首次注射抗原-完全佐剂免疫,以后每隔10d,以同样方法用抗原不完全佐剂加强免疫,共6次,最后一次免疫后5天,兔耳缘静脉采血1ml,分离血清,以双向琼脂免疫扩散鉴定血清的抗体效价。最后一次免疫后10d,以20%乌拉坦麻醉,颈动脉插管,收集血液,分离血清,按需要加入叠氮钠至0.02%;然后分装血清,于-20C~-70C保存


  1.4抗血清的免疫学特性鉴定


  1.4.1双向琼脂免疫扩散在1%琼脂糖凝胶上打梅花孔,中孔加入10^lKLH-CysLT2受体多肽,周围孔加10"l1/11/21/41/81/16


  1/32稀释的兔血清,37C湿盒内温育24h后观察,如中孔与周围孔之间出现白色沉淀线,则为阳性


  1.4.2效价测定采用间接ELISA法测定,采用研究组先前报道的方法[8]用抗原(KLH-CysLT2受体多肽)包被酶标板(预实验确定包被抗原浓度为1"g/ml),4C湿盒内过夜,洗板后加入倍比稀释(1/8~1/1047296)的待测兔血清,37°C湿盒内孵育2h洗板后,加入HRP标记的羊抗兔IgG(1/10000)2h,再加入底物溶液孵育10~30min,加中止液后于酶标仪490nm波长处测光密度同时,设立空白对照和阴性对照


  1.4.3特异性鉴定以ELISA法,测定可溶性抗原(KLH-CysLT2受体多肽)阻断兔血清抗体反应,以50%最大抑制浓度(IG。)作为敏感性指标为检测抗体与其他受体的交叉性,用KLH偶联的CysLTi受体和GPR17多肽作为抑制剂,以ELISA法测定各种多肽抑制抗体的反应,判断抗血清与CysLTi受体和GPR17有无交叉反应


  1.5CysLT2受体表达的鉴定


  1.5.1Westernblot测定CysLT2受体蛋白按报道的方法[w°提取大鼠与小鼠脑肾脏和肺组织的蛋白,以本研究制备的大鼠CysLTi体抗体、市售抗人CysLT2受体抗体或无免疫阴性血清(1:500)进行Westernblot检测,观察该受体的组织分布


  1.5.2RT-PCR测定CysLT2受体mRNA鼠CysLTi受体的上游引物:5-TAGACTTCTGCCTTCAGC-3,下游引物:5-TGACAGGACCTCCCCGAG-3,,PCR产物为1079bp;|3-actin上游引物:5,-TACAACCTCCTTGCAGCTCC-3,下游引物5-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3,PCR产物为285bp小鼠CysLT2受体的上游引物:5-GTCCACGTGCTGCTCATAGG-3'下游引物:5'-ATTGGCTGCAGCCATGGTC-3,PCR产物为180bp;|3-actin上游引物:5'-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3,下游引物:5'-GCAATGCCTGGGTACATGGTG-3',PCR产物为490bp


  1.5l3免疫组化测定CysLT2受体表达大鼠深度麻醉后,经心脏以生理盐水灌流后,用4%多聚甲醛灌流固定,取出脑置于4多聚甲醛固定过夜,然后在30%蔗糖溶液脱水3~7d,以冰冻切片机切成10"m切片,取囟门尾侧1.8~


  2.0mm脑切片用于实验。以CysLT2受体抗体(1:1000)与小鼠抗NeuN(1:100)或GFAP抗体(1:800)在4°C孵育过夜,然后,以FITC标记(绿色)或Cy3标记(红色)的二抗(1:100)在室温下孵育2h,在荧光显微镜下摄影。


  2结果


  2.1双向琼脂免疫扩散试验结果免疫3只兔,1号兔血清在1/1至1/16,23号兔抗血清在1/1至1/8,均与KLH-CysLT2受体多肽抗原有阳性沉淀线,表明血清与抗原有良好的反应性

  2.2效价测定结果根据ELISA测定结果,换算p/n=(标本OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值),得到效价曲线(图1)P/N值^21为阳性,1.笑P/N值<2.1为可疑,P/N值<1.5为阴性综合分析结果,1~3号兔血清的效价均在大于1/1047296由于3号兔血清的曲线靠左侧,其敏感性较12号兔高,以下实验均采用该兔血清。


  3特异性鉴定结果CysLT2受体抗血清1/16364,以KLHKLH~CysLT1受体多肽、KLH


  图1免疫家兔血清CysLT2受体抗体效价鉴定结果


  Fig.1IdentificationofantibodytitrationagainstCysLT2receptorintheserumfromtheimmunizedrabbits


  体反应KLHCysLT2受体多肽抗原的IC5()为0.5495Mg/ml;单用偶联蛋白KLH以及KLH-CysLTi受体KLH"GPR17多肽,则无明显阻断作用,无法计算其IC5()(图2)


  2.4组织样本中CysLT2受体的表达用Westernblot以本实验制备的抗体(1:500)检测CysLT2受体蛋白表达,大鼠和小鼠的脑肾脏和肺均有阳性条带,分子量约40kD,在小鼠组织的表达略高于大鼠,其中肾脏的表达较高(图3A)同时,与抗人CysLT2受体商品化抗体(:500)做了比较,结果表明可检测大鼠和小鼠组织的CysLT2受体蛋白表达,但阳性条带很弱(箭头所指,图3B)无免疫兔血清(1:500)用作阴性对照,在各组织无CysLT2受体阳性条带(箭头所指,图3C)为了确认CysLT2受体蛋白表达,以RT-PCR检狈UCysLT2受体mRNA表达,发现脑、肾脏和肺均有表达,小鼠肺的表达较弱(图3D)


  2.5大鼠脑内CysLT2受体的表达和分布免疫组化检测中,用制备的抗体(1:1000)检测CysLT2受体蛋白在大鼠脑内的表达和分布,结果显示,该受体主要表达在皮层和海马NeuN阳性的神经元,也表达在部分GFAP阳性的星


  KLH>CysLT2受体多肽、KLH~GPR17多肽及KLH对抗体活性无阻断作用。


  图2多肽抗原对CysLT2受体抗血清抗体活性的阻断作用Fig.2BlockingeffectsofpolypeptideantigensonantibodyactivityofCysLT2receptorantiserum


  形胶质细胞(图4)


  3讨论


  本研究制备了家兔抗大鼠CysLT2受体多克隆抗体,间接ELISA法表明,该抗体滴度达1/1047296并且,以3种受体亚型KLH-CysLT1KLH-CysLT2和KLH~GPR17多肽抗

  原做特异性阻断试验,证明该抗体具有较高的特异性,仅有CysLT2受体多肽能阻断其反应经Westernblot和免疫组化验证,表明该抗体可用于这两类实验Westernblot试验中,本研究制备的抗体表明CysLT2受体分子量约为40kD,对大鼠和小鼠组织均有较好的反应,表明能用于该两种动物的实验;而市售抗人CysLT2受体多克隆抗体(美国Cayman化学公司)虽有一定的反应,但非常微弱。因此,该抗体对于今后动物实验评价CysLT2受体蛋白变化,增加了一种有用的工具,加上我们最近制备的GPR17抗体181,完善了对CysLT受体亚型的研宄手段本研究以这一抗体为工具,初步探讨了CysLT2受体组织、细胞分布,表明CysLT2受体蛋白在脑、肺和肾脏的表达,其中,在肾脏表达A用CysLT2受体抗体以Westernblot法检测CysLT:受体蛋白表达(箭头所指),该蛋白分子量约40kD,在大鼠、小鼠的脑、肾脏和肺均有表达;B抗人CysLT2受体商品化抗体,对大鼠、小鼠组织的特异性低;C无免疫阴性兔血清用作对照,在相应部位无CysLT2受体阳性条带(箭头所指);DRT-PCR检测CysLT2受体mRNA表达,大鼠、小鼠的脑、肾脏和肺均有表达试验重复3~5次,每次结果均相似L肺;K:肾脏;B脑。


  图3大鼠和小鼠脑、肾脏和肺组织样本中CysLT2受体的表达


  较高;这一特点得到RT-PCR结果的证实,也与文献报道一致迄今,对于大鼠和小鼠组织的CysLT2受体表达,还未见蛋白水平变化的报道,主要用Northernblot或RT-PCR方法检测其mRNA表达水平_,因此,用我们制备的抗体有利于研究基因转录翻译后的功能表型特点。对于脑内表达的CysLT2受体的细胞分布,本研究还利用这一抗体以免疫组化方法证明,该受体亚型主要分布在神经元,也分布在部分星形胶质细胞这一分布特点与我们报道的


  当然,本研究主要在于制备CysLT2受体抗体,并对此做可用性的评价,初步发现的现象仅作为线索,对各种条件下CysLT2受体表达、分布变化以及各种调节因素,将在今后开展进一步研宄。


  中国论文网(www.lunwen.net.cn)免费学术期刊论文发表,目录,论文查重入口,本科毕业论文怎么写,职称论文范文,论文摘要,论文文献资料,毕业论文格式,论文检测降重服务。

返回医疗卫生列表
展开剩余(