强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性进行性自身免疫性疾病，其病变并非局限于关节，多引起关节以外的结缔组织的病变。肺脏因富含丰富的结缔组织与血管，很容易受累。前瞻性研究表明，AS肺部受累发生率达1.5%～30.0%[1]。 一般认为其发病与感染、遗传和免疫有关，但确切发病机制至今尚未明确。近年来研究表明，氧化应激（oxidative stress，OS）可能在AS相关的肺脏疾病发生、发展中起重要作用。 研究发现，核因子NF-E2相关因子（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2）通过与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）相互作用调节编码抗氧化蛋白，是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路。Kelch样ECH相关蛋白l（Kelch-like ECH-associated protein1， Keap1）-Nrf2-ARE作为机体内有效的抗氧化调节通路，对于防御、减轻氧化应激对人体的危害起着举足轻重的作用[2-3]。 Nrf2广泛存在于多种组织和细胞中，在调节氧化应激反应中起重要作用。正常情况下，Keap1将Nrf2以二聚体形式锚定于胞浆，促使胞浆内Nrf2持续泛素化并被蛋白酶不断降解，从而抑制Nrf2激活[4]。应激状态下，活性氧、活性氮和内外源性电子激活剂可氧化Keap1上的巯基或磷酸化Nrf2分子中的丝氨酸和苏氨酸残基，从而改变Keap1或Nrf2空间构象，抑制Keap1活性，导致Nrf2与Keap1分离，向细胞核内转移；在核内，Nrf2与小分子Maf蛋白结合形成二聚体，然后再与ARE结合，启动下游抗氧化酶基因及II相解毒酶基因转录，从而调节细胞氧化还原状态，抵抗氧化应激和其他毒性损伤，实现其抗氧化和解毒作用[5-7]。 Keap1-Nrf2-ARE信号通路的活化，是机体对环境毒物的一种应激防御反应能力的体现。 国外诸多研究表明，氧化水平升高和抗氧化能力下降可能与AS的发病有关[8-10]，但AS关节外病变肺功能的变化是否与氧化应激紊乱有关？迄今为止未见相关文献报道。Keap1-Nrf2-ARE作为机体内最为重要的内源性抗氧化应激通路，在AS肺功能损伤中扮演着何种角色尚不清楚。故本次研究我们先假设Keap1-Nrf2-ARE通路活化是AS患者肺功能降低的作用机制（简明机制示意图见图1），然后通过观察AS患者肺功能Keap1-Nrf2-ARE的变化，并将肺功能变化与Keap1-Nrf2-ARE通路指标进行相关性分析，旨在说明Keap1-Nrf2-ARE通路在AS患者肺功能降低中的作用，探讨肺功能降低的作用机制。 1 研究对象 选取2012年9月至2013年10月在本院就诊的AS患者120例，设为AS组，男90例，女30例，男∶女为3∶1；年龄18～60岁，平均（30.6±9.4）岁；病程1～24年，平均（9.2±7.5）年。所有患者均符合1984年美国风湿病学会（ACR）修订的纽约诊断标准[11]并参考2009年3月ASAS发布的中轴型SPA分类标准[12]。另设60例正常对照（NC）组，男45例，女15例，男∶女为3∶1，年龄20～54岁，平均（28.6±10.8）岁，均来自本院体检中心，经体检和免疫学检查排除自身免疫性疾病，均为身体健康、无明显器质性疾病者。两组在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究方案已通过本院伦理审查委员会审批，所有受试者均签署知情同意书。 2 观察指标及方法 2.1 肺功能测定 采用德国Jager MasterScreen自动肺功能检测仪测定AS患者肺功能，测定前患者禁止吸烟2周。测定项目包括：用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼气容积（FEV1）、最大通气量（MVV）、最大呼气流量（PEF）、25%肺活量位的最大呼气流量（FEF25）、50%肺活量位的最大呼气流量（FEF50）、75%肺活量位的最大呼气流量（FEF75）。为了消除性别、年龄、身高、体质量等因素对肺功能测定值的影响，以上参数均以实测值/正常预计值（%）表示，肺功能各指标皆以实测值/正常预计值< 80%为异常。 2.2 氧化应激指标测定 取患者血清10 mL，置 3 000 r·min-1离心机离心15 min，分离后进行4等 份分装，-80 ℃冷冻保存统一检测。所有指标均参照试剂盒说明书进行操作。参照标准曲线计算标本相应指标的测定值。采用酶联免疫分析法（ELISA法）检测AS组和NC组血清中通路蛋白（Keap1、Nrf2）、氧化应激指标[丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（TAOC）]、细胞因子（IL-18、TNF-α、IL-4、IL-35）含量。Keap1、 Nrf2试剂盒购自美国Millipore公司；MDA、ROS、RNS、SOD、CAT、TAOC试剂盒购自南京建成生物工程研究所；IL-18、TNF-α、IL-4、IL-35试剂盒购自英国伯明翰公司。 2.3 实验室指标测定 所有被选对象均于清晨空腹时静脉采血10 mL，采集后标本立即送往本院实验中心检测，检测指标主要有：ESR、超敏C-反应蛋白（hs-CRP）、IgG、IgA、IgM。检测方法：ESR用魏氏法，以mm·h-1表示；hs-CRP、IgG、IgA、IgM用日立7 060型全自动生化分析仪进行测定，以mg·L-1表示。 2.4 主要症状、体征积分量化评分标准 参照国家食品药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》[13]，将具体的关节症状体征、肺功能症状换算成积分值。 2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。为连续性变量的实验数以表示，样本均采用Kolmogorov-Smirnov正态性检验；计量资料采用t检验；计数资料采用χ2检验；采用Spear- man软件进行相关性分析。以P < 0.05或P < 0.01 为差异有统计学意义。 3 结 果 3.1 两组肺功能变化检测结果 120例AS患者， 肺功能参数一项指标异常率为58.33%，肺功能参数二项指标异常率49.17%，肺功能参数三项指标异常率38.33%，肺功能参数四项指标异常率24.17%，肺功能参数五项指标异常率8.33%，肺功能参数六项指标异常率5.00%，肺功能参数七项指标异常率1.67%。见图2。与60例NC组肺功能异常率比较，AS组肺功能异常率为58.33%，NC组异常率为5.00%。见表1。 3.2 两组肺功能参数、氧化应激指标、细胞因子、炎症指标的比较 与NC组比较，AS组患者FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75值及SOD、CAT、TAOC值均显著降低（P < 0.01或P < 0.05）；Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA值显著升高（P < 0.01 或P < 0.05）；IL-18、TNF-α、ESR、CRP值显著升高（P < 0.01）；IL-4、IL-35值显著降低（P < 0.01或P < 0.05）。见表2。 3.3 AS患者外周血Keap1、Nrf2异常者肺功能变 化 以60例NC组外周血Keap1、Nrf2数值统计正常值区间，Keap1（1.56～8.04 ng·mL-1）、 Nrf2（1.98～10.10 ng·mL-1），筛选出AS患者Keap1、Nrf2异常组别。与Keap1正常组比较，Keap1 异常组FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75值降低；与Nrf2正常组比较，Nrf2异常组FEV1、MVV、PEF、FEF25、FEF50、FEF75值降低（P < 0.05或P < 0.01）。与Nrf2异常组比较，Keap1异常组FEV1、PEF、FEF50、FEF75值降低（P < 0.05）。见表3。 3.4 AS患者外周血Keap1和Nrf2表达与氧化应激指标、细胞因子、肺功能症状等指标的相关分析 Spearman相关性分析结果显示，AS患者外周血Keap1表达与ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、CRP、胸闷及气短症状呈正相关（P < 0.05或P < 0.01）；与SOD、TAOC、IL-4、IL-35呈负相关（P < 0.05或P < 0.01）。AS患者外周血Nrf2 表达与SOD、CAT、IL-4、IL-35呈负相关（P < 0.05或P < 0.01）；与ROS、RNS、MDA、胸闷症状呈正相关（P < 0.05或P < 0.01）。见表4。 3.5 AS患者肺功能参数与氧化应激指标、症状体征积分等指标的相关分析 Spearman相关性分析显示，FEV1与SOD、CAT、TAOC、IL-4、IL-35呈正相关，与Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、CRP、胸闷、气短、呼吸困难呈负相关；MVV与SOD、TAOC、IL-4、IL-35呈正相关，与Keap1、Nrf2、ROS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、胸闷、气短呈负相关；PEF与SOD、CAT、IL-4呈正相关，与Keap1、Nrf2、ROS、IL-18、胸闷、脊柱疼痛呈负相关；FEF50与SOD、CAT、TAOC、IL-4呈正相关，与Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、胸闷、气短呈负相关；FEF75与SOD呈正相关，与Keap1、ROS、RNS、胸闷呈负相关（P < 0.05或P < 0.01）。见表5。 4 讨 论 AS是以骶髂关节和脊柱中轴关节慢性炎症为主的自身免疫性疾病，临床上若延误诊治，易引起关节以外的结缔组织的病变[14]。肺脏因含丰富的结缔组织与血管，因此很容易受累。AS患者肺脏受累可表现为肺上部囊性纤维化、胸膜病变、肺血管炎等，这些病理改变导致了肺功能的变化。自由基是机体内很强的氧化反应能力的分子、离子、原子或原子团，当自由基过度产生或机体的抗氧化防御体系功能受损时，机体将处于氧化应激状态，从而导致组织细胞损伤[15]。 肺功能变化直接表现为FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75降低。肺功能参数FVC、FEV1、MVV、PEF主要反映的是通气功能，而参数FEF25、FEF50、FEF75反映的是小气道的功能。本研究结果显示，58.33%的AS患者存在肺功能降低，与NC组比较，AS患者FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75值均显著降低（P < 0.01或 P < 0.05）。即AS患者肺功能降低主要表现为通气功能降低，并伴有不同程度的小气道通气障碍。与NC组比较，AS患者血清中SOD、CAT、TAOC值均显著降低（P < 0.01或P < 0.05）；ROS、RNS、MDA值显著升高（P < 0.01或P < 0.05）。ROS、RNS、MDA是反映机体氧化水平的关键指标；而SOD、CAT、TAOC是反映机体抗氧化水平的关键指标。本研究发现肺功能降低的AS患者存在氧化应激紊乱，处于氧化水平升高和抗氧化能力明显下降的状态。与NC组比较，AS患者IL-18、TNF-α、ESR、CRP值显著升高（P < 0.01），IL-4、IL-35值显著降低（P < 0.01或P < 0.05）。IL-18、TNF-α属于致炎细胞因子[16]，而IL-4、IL-35属于抗炎细胞因子[17]，ESR、CRP可反映疾病的活动程度。本研究发现肺功能降低的AS患者处于疾病活动状态且存在细胞因子失衡，炎性细胞因子含量明显升高。与NC组比较，肺功能降低的AS患者Keap1、Nrf2表达上升。这表明肺功能降低的AS患者存在Keap1-Nrf2-ARE通路的活化。 为进一步验证Keap1-Nrf2-ARE通路在AS患者肺功能降低中的影响，本研究发现，与AS患者外周血Keap1、Nrf2正常组比较，Keap1、Nrf2异常组肺功能参数FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75值降低。提示AS患者外周血Keap1、Nrf2升高会直接或间接导致肺功能降低。 本研究通过相关分析得知，肺功能降低的AS患者FEV1与SOD、CAT、TAOC、IL-4、IL-35呈正相关，与Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、CRP、胸闷、气短、呼吸困难呈负相关；MVV与SOD、TAOC、IL-4、IL-35呈正相关，与Keap1、Nrf2、ROS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、胸闷、气短呈负相关；PEF与SOD、CAT、IL-4呈正相关，与Keap1、Nrf2、ROS、IL-18、胸闷、脊柱疼痛呈负相关；FEF50与SOD、CAT、TAOC、IL-4呈正相关，与Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、胸闷、气短呈负相关；FEF75与SOD呈正相关，与Keap1、ROS、RNS、胸闷呈负相关。而AS患者外周血Keap1表达与ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、CRP、胸闷及气短症状呈正相关（P < 0.05或P < 0.01）；与SOD、TAOC、IL-4、IL-35呈负相关（P < 0.05或P < 0.01）。 AS患者外周血Nrf2 表达与SOD、CAT、IL-4、IL-35呈负相关（P < 0.05或P < 0.01）；与ROS、RNS、MDA、胸闷症状呈正相关（P < 0.05或P < 0.01）。 这提示Keap1、Nrf2的水平与AS疾病活动状态、氧化应激状态、细胞因子平衡、肺功能参数明显相关，当体内ROS、RNS等氧化指标含量升高时，Keap1、Nrf2表达上升，Keap1-Nrf2-ARE信号通路活化后，抗氧化指标SOD、CAT、TAOC含量下降，机体抗氧化能力降低，促使细胞因子失衡，IL-18、TNF-α等促炎细胞因子含量升高，而IL-4、IL-35等抑炎细胞因子含量降低，ESR、CRP等疾病活动性指标升高，导致免疫复合物异常沉积增多，引起AS发病；若免疫复合物异常沉积于肺组织，使肺组织小血管基底膜出现血管炎改变，从而损害肺毛细血管结构，致使肺组织或器官受到损伤或破坏，肺毛细血管有效血流量降低，肺功能出现限制性或混合性通气功能障碍，肺功能降低。 本研究结果与研究前假说基本一致（见图3），鉴于以上研究结果，我们可以认为氧化应激可能参与了AS患者肺功能降低的发生与发展，Keap1-Nrf2-ARE信号通路的活化可能是AS患者肺功能降低的机制。 5 参考文献 [1]蒋明，朱立平，林孝义.风湿病学[M].北京：科学出版社，1995：941-964. 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