基因中的内含子和外显子(基因有内含子外显子吗)

【关键词】 少精子症;y染色体;daz外显子;聚合酶链反应;不育,男(雄)性

【摘要】 目的 探讨y染色体无精子缺失(daz)基因外显子与无精子症的关系。方法 应用多重聚合酶链反应(pcr)技术对97例无精子症病人和60例正常生育男性daz基因外显子进行检测。结果 97例无精子症病人daz基因外显子缺失4例,缺失率4.12%，正常生育男性daz外显子未检测到缺失。结论 daz基因外显子缺失可导致无精子症;检测不育病人是否有y 染色体微缺失，对于通过辅助生殖技术(art) 将这种基因缺陷遗传给下一代的可能性评估具有重要意义。

【关键词】 少精子症;y染色体;daz外显子;聚合酶链反应;不育,男(雄)性

　the relationship between daz exon and azoospermia wang hengcai, lu xilan, hou mengyan, et al (shandong university affiliated ji′nan central hosoital, ji′nan 250013, china); [abstract] objective to explore the relationship between daz exon in y chromosome and azoospermia. methodsdaz exons were detected by polymerase chain reactions (pcr) in 97 patients with azoospermia and 60 normal men. results of 97 patients, daz exon deletion was found in four (4.12%). however, daz exon deletion was not found in the healthy subjects. conclusion deletion of daz exon may result in azoospermia. a detection of whether an infertile patient is suffering from y microdeletion is of great importance to assess the possibility of descending this gene defect to offspring through assisted reproductive technology.

　　[key words] oligospermia; y chromosome; daz exon; polymerase chain reaction; infertility, male

　　y染色体对性发育和精子发生是必需的,y染色体上特殊基因的缺失、点突变和微重排等异常均可影响男性生精功能。为了明确y染色体azfc区无精子缺失(daz)基因外显子与无精子症的关系，本研究对97例无精子症病人和60例正常生育男性的daz基因6个外显子进行检测，现将结果报告如下。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　2005年1月—2008年3月，我科收治男性不育、无精子症病人97例，病人平均年龄26.9岁。病人的精液标本经过离心后显微镜检查，共3次，每次检查间隔7～21 d，均没有发现精子，符合世界卫生组织的诊断标准。通过临床检查、性激素检测等排除精索静脉曲张、附睾损伤、阻塞性无精子症或其他泌尿生殖系统疾患。正常生育男性(对照组)60例，均有生育史，精液检查2次均正常。经知情同意后，抽取外周血液提取基因组dna。1.2 方法

　　1.2.1 试剂 基因组dna抽提试剂盒由上海生工公司出品(cat. no. sk1251);taq酶、dntp购自大连宝生物公司;红细胞裂解液为本实验室自制。

　　1.2.2 外周血基因组dna提取 采用常规酚氯仿法抽提。

　　1.2.3 pcr引物设计 主要检测daz 1～4基因编码重要功能区片段外显子1～6的区域， daz1、daz2/3、daz4/5、daz6四对引物由invitrogen公司合成。引物序列见表1。

　　1.2.4 pcr反应 pcr体系和反应条件按照文献及引物、目的片段长度等情况决定。pcr 反应体积为50 μl,含有1.5 mmol/l mgcl2, 10 mmol/l trishcl(ph 8.0),50 mmol/l kcl，200 μmol/l dntp，taq dna聚合酶1 u。pcr 反应参数为94 ℃预变性4 min后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共完成35个循环，最后72 ℃延伸3 min,然后置4 ℃保温。产物用10 g/l琼脂糖凝胶电泳,60 v恒压电泳30 min，溴乙锭染色后在紫外线灯下观察结果,并照相保存。为排除假阳性反应，对微缺失的标本进行3次pcr 重复检测, 上述缺失仍无扩增信号,则证实微缺失的存在。　表1 daz外显子缺失检测的pcr引物序列引物 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) 扩增产物daz1cattggctcaggccgatacccctcaggtctttccttcaa313 bpdaz2/3tgtatgggttttgcctgcatttgcatttatacaagggtcagaa665 bpdaz4/5ccacgtactgtatgatggtgatttttgaaaagctacacgggtca650 bpdaz6tgacccgtgtagcttttcaacaattccacagagggaagga264 bp

　　2 结 果

　　97例无精子症病人中,daz外显子缺失(图1)4例,缺失率4.12%;60例正常生育男性daz外显子全部阳性，即无缺失。4例微缺失病人每侧的睾丸体积3～12 ml, 卵泡刺激素(fsh)全部高于正常值，1例病人泌乳素(prl)高于正常值。

　　m：dna marker dl2000;④～⑦为正常对照，①～③为daz 外显子1、4、5区缺失;⑧～⑩为daz 外显子2、3、6区缺失。

　　图1 daz外显子pcr扩增电泳图

　　3 讨 论

　　精子发生是在以特异基因为主导的多基因相互作用的遗传网络调控下的复杂过程。 tieplolo等[1]发现无精子病人有y染色体长臂(yq11.23)缺失，推测该区存在调控精子生成的部位，由于该核型病人几乎都无精，故称该部位为azf。现已明确至少有3个精子生成部位(azfa、azfb、azfc)，分别位于yq11.23的近、中、远端。这些区域的基因微缺失可引起精子发生障碍,继而引起男性不育。

　　daz为多拷贝基因，又称daz家族，是azfc的最佳候选基因[2]。daz在睾丸特异性表达，表明daz 基因只参与男性特有的生理过程。国内文献报道，daz基因微缺失率为7.9%～15.2%不等，少精子症缺失率为5.0%～19.0%，无精子症缺失率为10.0%～36.6%[35]。本文资料显示，无精子症病人daz基因外显子缺失率为4.12%。国内文献尚未见关于daz基因外显子缺失的报道。

　　本文资料的结果显示，4例daz基因外显子缺失病人每侧睾丸的体积从3 ml至正常不等。从唯支持细胞综合征到生精不足均有daz基因缺失,提示daz基因在精子生成过程中不起决定性作用,其作用可能是在精子生成早期影响精原细胞的增殖或前体细胞的分化,使精子发育阻断于不同阶段,出现多样性表型[6]。

　　已有研究结果显示，部分生精障碍的无精子、严重少精子病人，是由于y染色体azf区的微缺失而造成的[7]。但是,本文资料及相关文献显示大部分无精子病人y染色体并没有检测出微缺失,这说明可能因为存在某些更微小的缺失或点突变,或因为某些精子发生相关基因位于所研究的区域之外,甚至位于常染色体上,因此有必要再去寻找新的精子发生基因。

　　y 染色体微缺失的检测使临床上一些原因不明的无精症或少精症病人从分子水平上明确了病因, 为临床医师的诊疗过程提供了临床依据。检测不育病人是否有y染色体微缺失，对于通过辅助生殖技术 (art) 将这种基因缺陷遗传给下一代的可能性评估也具有重要意义。

【参考文献】
　[1]tiepolo l, zuffardi o. localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human y chromosome long arm[j]. hum genet, 1976,34(2):119124.

　　[2]张孝禹,王冬梅. 无精子因子及其临床检测的研究进展[j]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(6):560561.

　　[3]魏宏,张玉兰. 特发性无精子症和严重少精子症患者daz 基因缺失的分析[j]. 中国优生与遗传杂志, 2002,10(4):106108.

　　[4]赵静,姚元庆,王香玲,等. 特发性无精症与严重少精症患者daz 基因缺失的研究[j]. 中华医学遗传学杂志, 2002,19(5):428429.

　　[5]徐计秀,张利,田秀珠,等. 男性不育患者精子质量及daz基因分析[j]. 中国性科学, 2004,13(2):13.

　　[6]reijo r, alagappan r k, patrizio p, et al. severe oligozoospermia resulting from deletions of azoospermia factor on y chromosome[j]. lancet, 1996,347:12901293.

　　[7]张玉萍,王以新,刘秀林,等. y染色体长臂异常致男性性征改变三例[j]. 中华医学杂志, 1999,79:672.

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