摘要：目的 本研究采用巢氏PCR（nMSP法）和亚硫酸氢盐修饰后测序法（BSP法）方法，检测手术切除脑胶质瘤组织中候选抑癌基因EDNRB基因启动子区甲基化状态，探讨EDNRB基因启动子的异常甲基化水平在脑胶质瘤发生发展中的作用以及与临床病病理资料之间的关系。方法 选取经病理证实的20例脑胶质瘤患者，术前均未行放疗和化疗，收集切除的肿瘤组织。同时收集2例脑挫裂伤患者正常脑组织进行对照，应用nPCR方法和BSP方法检测标本中EDNRB基因启动子区CpG岛的甲基化状态。结果 正常脑组织未见甲基化，低级别（I-II级）胶质瘤中与高级别组（Ⅲ-IV级） EDNRB基因启动子甲基化率之间无明显差别（X2=0.152.402， P=0.696）。结论 EDNRB基因的甲基化是肿瘤发生的早期事件，EDNRB基因甲基化在脑胶质瘤中较为普遍，与肿瘤进展基本无关。EDNRB基因位于13q22，长约24kb，含7个外显子和6个内含子，编码的非选择性内皮素受体B是一种G蛋白偶联的跨膜受体蛋白，在人体内分布广泛，在心血管系统、胃肠道、肺、肾、肾上腺、子宫、前列腺、脑等的血管内皮细胞均有表达。
关键词：EDNRB基因；甲基化；脑胶质瘤
EDNRB基因位于13q22，长约24kb，含7个外显子和6个内含子，编码的非选择性内皮素受体B是一种G蛋白偶联的跨膜受体蛋白，在人体内分布广泛，在心血管系统、胃肠道、肺、肾、肾上腺、子宫、前列腺、脑等的血管内皮细胞均有表达。EDNRB基因所在的染色体位点13q22是肿瘤发生过程中一个经常出现基因缺失的区域，目前推测该区域可能有某些肿瘤抑制基因存在，他们对肿瘤的发生发展有着重要的作用。台湾一项研究发现在白血病患者中EDNRB启动子甲基化一个普遍现象[1]。法国一项研究显示EDNRB启动子甲基化可能在早期诊断前列腺癌中作为一种肿瘤标志物[2]。目前尚未见到在神经胶质瘤中研究EDNRB甲基化状态的报道。
1临床资料
取安徽医科大学第一附属医院近2年胶质瘤患者切除肿瘤标本20例。记录患者的临床资料包括年龄、性别、肿瘤部位、WHO分类，所有患者均为首次手术，术前均未行放疗和化疗，采取标本时选取无组织或出血部位。其中男性10例，女性10例。平均年龄45.2岁，肿瘤均为显微镜下全切。WHO肿瘤分级：Ⅰ-Ⅱ级8例，Ⅲ-Ⅳ级12例，2例正常脑组织取自脑挫裂伤患者失活脑组织。巢式PCR（nested PCR），是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。外引物F5'-GATTGAATTTTATTTTGGGGTTT-3'，R-TATATCAAACTCTACATTTTACCCC；内引物F5'-AATTATTGATTGAATTTT
ATTTTGGG-3'，R5'-CTG GCC GAA AGA AAG AAA TGGT-3'。首轮PCR的反应体系为25μl。10×PCR buffer2.5μl，dNTP0.5μl，模板4μl，引物（F、R）各1.5μl，MgCl22.5μl，Taq酶0.2μl，加双蒸水至25μl；PCR反应流程如下：95℃10分钟预变性，PCR循环99℃ 6min，65℃120min，72℃33min。首轮PCR为30个循环，2μl首轮产物以1：4加双蒸水稀释，作为样本加入次轮反应，重复上述过程。
由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。
2产物结果测序
根据BSP方法产物测序后结果，若原基因序列CpG岛中的C即胞嘧啶发生了甲基化反应，则测序后应保持不变；若原基因序列中的胞嘧啶未发生甲基化反应，则经亚硫酸氢盐修饰、PCR扩增和测序后应转变为胸腺嘧啶（T）。根据测序结果可确定目的片段内每个CpG岛中胞嘧啶（C）的甲基化状态，目前是检测目的基因启动子区CpG岛甲基化水平的金标准。全部测序工作由上海生物芯片公司完成。
用SPSS12.0统计软件包对实验数据进行X2检验，推断两个或两个以上总体率之间有无差别和两变量间有无相关关系。采用精确概率法进行统计分析，P<0.05时，表示差异有显著性。
3结果
所抽提的20例标本中，经检测有16例DNA质量合格，随后对此16例标本进行甲基化修饰及测序检测。
2例正常脑组织中未检测出EDNRB基因甲基化。16例标本中，检测出6例标本的EDNRB基因发生了启动子的甲基化（37.5%，6/16），远高于正常组织的甲基化率（0%）；但因正常组织数量太少，故二者的差异未行统计学分析。低级别（I-II级）胶质瘤中EDNRB基因启动子甲基化率为42.86%（3/7），而高级别组（Ⅲ-IV级） EDNRB基因启动子甲基化率为33.33%（3/9），通过分析表明两者之间无明显差别（X2=0.152，P=0.696）。患者年龄、性别、肿瘤病理类型、肿瘤大小和肿瘤部位等因素与EDNRB基因甲基化无明显相关。
我们对EDNRB基因启动子甲基化情况与临床病理资料的关系进行了分析，低级别（I-II级）胶质瘤中EDNRB基因启动子甲基化率为42.86%（3/7），而高级别组（Ⅲ-IV级） EDNRB基因启动子甲基化率为33.33%（3/9），通过分析表明两者之间无明显差别（X2=0.152.402，P=0.696），本研究没有发现EDNRB基因甲基化与患者的年龄、性别、肿瘤病理类型、肿瘤大小等因素相关。
4讨论
EDNRB基因编码的非选择性内皮素受体B是一种G蛋白偶联的跨膜受体蛋白，在人体内分布广泛，在心血管系统、胃肠道、肺、肾、肾上腺、子宫、前列腺、脑等的血管内皮细胞均有表达。EDNRB基因所在的染色体位点13q22是肿瘤发生过程中一个经常出现基因缺失的区域，本实验我们对EDNRB基因启动子甲基化情况与临床病理资料的关系进行了分析。实验发现，EDNRB基因甲基化在脑胶质瘤中的发生率为37.5%，而正常脑组织中未检测出甲基化现象；说明EDNRB基因的甲基化在脑胶质瘤中是一种较为普遍存在的现象，可能与肿瘤的发生有关。在级别为I-II级的胶质瘤中，EDNRB基因启动子甲基化率为42.86%（3/7），而高级别组（Ⅲ-IV级） EDNRB基因启动子甲基化率为33.33%（3/9），通过分析表明两者之间无明显差别（X2=0.152.402，P=0.696）；说明EDNRB基因的甲基化可能与肿瘤的进展无关。我们此研究发现，与其他肿瘤的研究报道基本一致：即抑癌基因的甲基化是肿瘤发生的早期事件，而与肿瘤进展基本无关。
肿瘤发生时常出现不同程度的DNA甲基化模式改变，通过对启动子区高甲基化CpG岛的检测从而发现因DNA甲基化沉默的抑瘤基因，已成为一种寻找肿瘤相关基因的新方法。某些基因高甲基化具有肿瘤细胞特异性，可作为基因标志应用于肿瘤的诊断及临床预后估价研究胶质瘤患者的肿瘤组织和血浆中的肿瘤特异性DNA甲基化情况，结果发现90%患者的胶质瘤中含有启动子的甲基化，60%以上患者血浆中也可以检测到相关基因的启动子甲基化。因此，某些基因启动子的甲基化水平能够作为诊断胶质瘤的生物学指标。但哪些基因具有较高的特异性，哪些可以通过非侵入性方法进行检测以及更加简单快速检测基因甲基化的实验方法还需要进一步进行研究。
参考文献：
[1]Yu L，Liu C，Vandeusen J，et assessment of promoter methylation in a mouse model of cancer identifies ID4 as a putative tumor suppressor gene in human leukemia[J].Nat Genet，2005，37（3）：265-274.
.Oncogene，2002，21（35）：5450-5461.
[3]Sidransky ng molecular markers of cancer[J].Nat Rev Cancer，2002，2（3）：210-219.
.Neurosurgery，2009，64（3）：455-461.
.Cancer Investigation，2006，24（1）：35-40.
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