五田保肝液对酒精性肝病大鼠肝细胞凋亡的影响有多大(五田保肝液对酒精性肝病大鼠肝细胞凋亡的影响)

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【关键词】 五田保肝液;酒精性肝病;肿瘤坏死因子α;caspase3

【摘要】 目的 探讨五田保肝液对酒精性肝病大鼠肝细胞凋亡和肝组织肿瘤坏死因子(tnf)α、caspase3 mrna表达的影响。方法 将100只wistar大鼠随机分成6组：对照组10只、模型组、五田保肝液低、中、高剂量组、易善复组各18只，采用白酒辅以吡唑、玉米油的混合食料灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型，12 w末处死大鼠， tunel法检测肝细胞凋亡情况，实时定量rtpcr法检测tnfα、caspase3 mrna的表达。结果 五田保肝液可降低酒精性肝病大鼠肝细胞的凋亡指数(ai)和肝组织tnfα、caspase3 mrna的表达，且以中、高剂量效果更加显著; tnfα、caspase3 mrna的表达与ai呈正相关(r=0.803,r=0.795,p<0.01)。 结论 五田保肝液尤其是中、高剂量对大鼠酒精性肝病肝细胞凋亡具有抑制作用，其机制可能与降低tnfα、caspase3 mrna的表达有关。

【关键词】 五田保肝液;酒精性肝病;肿瘤坏死因子α;caspase3

长期大量酒精摄入可导致酒精性肝病(alcoholic liver disease，ald)的发生。然而ald的发病机制仍未完全阐明，近年来研究认为酒精诱发的肝细胞凋亡在ald的发生发展中起着十分重要的作用。本文经过长时间临床验证，有确切防治ald疗效的专利制剂“五田保肝液”(专利号：cn02158170.3)作为研究对象，探讨其对ald大鼠肝细胞凋亡的干预作用及分子机制，为防治ald提供实验指导和理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　wistar雄性大鼠100只，中国医学科学院实验动物研究所提供〔许可证号：scxk9(京)20050013〕，体重200 g左右。

　　1.2 主要实验试剂

　　五田保肝液由深圳市三九现代中药有限公司提供;易善复(多烯磷脂酰胆碱胶囊)：赛诺菲安万特(北京)制药有限公司生产;批号/bn：d8099;规格228 mg/片;62度牛栏山二锅头：由北京顺鑫农业股份有限公司生产;吡唑：购自上海晶纯试剂有限公司;玉米油：购于中粮食品营销有限公司;in situ cell death detection kit试剂盒购于美国roche公司;rna提取试剂盒rnasolv reagent购自omega公司;sybr primescript tm rtpcr kit试剂盒购自takara公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 实验分组和模型制备

　　大鼠适应性饲养1 w，分为对照组(n组)10只、模型组(m组)、五田保肝液低剂量组(wⅰ组)、中剂量组(wⅱ组)、高剂量组(wⅲ组)、易善复组(y组)各18只。m组、wⅰ组、wⅱ组、wⅲ组、y组大鼠均以62度牛栏山二锅头酒(10 ml·kg-1·d-1)、玉米油(2 ml·kg-1·d-1)、吡唑(25 mg·kg-1·d-1)混合物灌胃,2次/d,早晚各1次。wⅰ组、wⅱ组、wⅲ组大鼠于两次灌胃之间分别给予0.51、1.02 g·kg-1·d-1(成人等剂量)、2.04 g·kg-1·d-1的五田保肝液灌胃; y组和m组大鼠于早晚两次灌胃之间分别给予相当于成人等剂量的易善复(0.12 g·kg-1·d-1)和相应剂量的生理盐水灌胃，n组则3次/d以生理盐水灌胃。各组大鼠实验期间均予全价营养颗粒饲料喂养，自由进食饮水。造模时间为12 w。

　　1.3.2 取材

　　于第12周末，所有大鼠禁食12 h，颈椎脱臼处死大鼠后迅速剖腹取出肝脏，冰生理盐水冲洗，然后取肝右叶部分组织置于冻存管后迅速投入液氮中冷冻保存，以备检测分子生物学指标之用;取肝左叶组织投入10%中性甲醛溶液固定组织，切片，以备检测肝组织形态学指标。

　　1.3.3 tunel法检测大鼠肝细胞凋亡情况

　　阳性定位在细胞核,凋亡细胞核呈棕黄色。观察不少于5个高倍视野(400倍)，记数至少500个细胞。以凋亡指数反映凋亡程度。计算公式:凋亡指数(ai)=凋亡阳性细胞数/细胞总数×100%。

　　1.3.4 实时定量rtpcr检测肿瘤坏死因子(tnfα)、caspase3 mrna的表达

　　引物的设计与合成：tnfα引物序列：正义链：5′aagttcccaaatgggctccct3′;反义链：5′ctgctcctctgcttggtggttt3′;caspase3引物序列：正义链5′cagacagtggaactgacgat3′;反义链：5′tttcagcatggcgcaaagtg3′;以gapdh为内参，其引物序列为：正义链：5′cccccaatgtatccgttgtg3′;反义链：5′tagcccaggatgccctttagt3′。总rna的提取和检测：按rnasolv reagent的操作说明书提取大鼠肝组织总rna，紫外分析及琼脂糖电泳检测总rna的纯度、浓度及完整性。进行逆转录pcr反应。反应结束后,使用7300 system sds software软件分析pcr过程中样本的ct值，每个标本设3个复孔，计算平均ct值，每一次反应均设定阴性对照。采用2△△ct计算各目的基因相对反应起始拷贝数。

　　1.4 统计学分析

　　用spss17.0统计软件包进行分析，数据以x±s表示，各组数据比较采用oneway anova方法检验，相关分析采用person法。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠一般情况观察

　　正常组大鼠健康状况良好，整个实验过程无1只死亡。模型组大鼠精神萎靡，毛发干枯蓬乱，部分大鼠出现脱毛现象，食量减少，大便稀，小便黄，至造模结束，体重增长不明显，至12 w末，因酒精误入气管死亡3只，因酒精急慢性中毒死亡7只。各给药组大鼠情况好于模型组，精神较活跃，体重增加较之模型组快。其中wⅰ、wⅱ、wⅲ组和y组因酒精误入气管分别死亡4、5、5、5只，因急慢性酒精中毒分别死亡4、4、3、4只。

　　2.2 tunel法观察肝细胞凋亡情况

　　模型组大鼠肝细胞细胞凋亡指数(ai)明显高于对照组(p<0.01)，其余各组的ai与对照组相比也有所升高(p<0.01)，但是wⅱ、ⅲ组和y组与m组相比ai下降明显(p<0.01)，而wi组和m组相比ai无显著性差异(p>0.05)。见表1。

　　2.3 对ald大鼠肝组织tnfα、caspase3 mrna表达的影响

　　m组tnfα、caspase3 mrna的表达明显高于n组(p<0.01)，而五田保肝液各剂量组和y组tnfα、caspase3 mrna的表达明显低于m组(p<0.01)，mi组tnfα、caspase3 mrna的表达和y组caspase3 mrna与n组相比，有所升高，差别具有显著性(p<0.05)。见表1。表1 五田保肝液对ald大鼠肝细胞ai、肝组织tnfα、caspase3 mrna表达的影响

　　2.4 ald大鼠肝组织tnfα、caspase3 mrna表达与肝细胞ai的相关性分析

　　tnfα、 caspase3 mrna的表达与ai呈正相关(r=0.803，r=0.795，p<0.01)。

　　3 讨 论

　　细胞凋亡是一种不同于坏死的细胞死亡方式，是细胞在基因的指导下“主动自杀”的过程。凋亡是ald过程中肝细胞死亡的重要方式〔1～3〕。肝细胞凋亡的程度与ald病情有明显的相关性〔4〕,所以试图阐明ald肝细胞凋亡的机制，可能为ald的防治提供新的思路和靶点〔5〕。

　　酒精及其代谢产物可激活肝的kupffer细胞，窦内皮细胞等，从而分泌大量tnfα，研究表明，低水平的tnfα参与肝细胞正常的生长分化过程，但是高水平的tnfα的表达却可诱导肝细胞的凋亡〔6〕。caspase家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡的细胞因子网络中居中心地位，研究认为caspase3是引发细胞凋亡蛋白酶级联反应中的“核心”蛋白酶〔7〕，被称为死亡蛋白酶。

　　目前研究认为，细胞内的死亡信号可通过细胞外途径(细胞表面死亡受体途径)和细胞内途径(线粒体引发途径)两条主要的通路导致细胞凋亡，在细胞外途径中，死亡信号发挥作用依赖于死亡受体和死亡配体的结合〔8〕。tnfα与其受体(tnfrⅰ)结合后，聚集形成胞内死亡复合体，通过一系列信号转导，最终激活caspase3，导致细胞凋亡发生〔9〕。已经探明tnfα、caspase3凋亡这一信号途径是重要的细胞凋亡信号传导途径。本实验研究发现，模型大鼠肝细胞ai显著高于对照，和tnfα、caspase3 mrna的表达呈正相关，进一步证实酒精及其代谢产物的刺激使tnfα高表达，进而激活caspase3是诱发ald肝细胞凋亡的机制之一。

　　对于ald的治疗，目前临床方法并不多且效果不肯定。而中医药具有辨证施治的特点和整体调节优势,对ald的治疗具有广阔的应用前景。中医认为饮酒能够助湿生热，长期过量饮酒则湿热酒毒内蕴，这是ald的病机所在。专利制剂五田保肝液由田基黄、垂盆草、败酱草、丹参、五味子、山楂、草决明、泽泻、柴胡、生甘草组成。方中田基黄清热利湿，解毒、散瘀、消肿、止痛，垂盆草清热解毒、利尿消肿共为君药，以解湿热酒毒。败酱草清热解毒，排脓破瘀、丹参活血祛瘀共为臣药，助君药清热利湿。酸入肝，五味子、山楂味酸能收敛肝阴，山楂亦能活血化瘀，草决明清肝热、利水，泽泻利水渗湿、泄热，共为佐药。柴胡主入肝经，引诸药入肝经，为引经药。金匮曰：见肝之病，知肝传脾，当先实脾。甘草味甘补脾、又能解毒，调和诸药，与柴胡共为使药。该组方君臣佐使完备，无毒副作用。根据ald多因热、湿、毒、虚而致，设立了以“清肝利湿，活血化瘀，分化解毒”为治疗大法。经过多年的临床实践，证实对ald具有明确疗效。

　　本实验研究发现，ald治疗各组和易善复虽然ai也高于对照，但是中药中、高剂量和易善复的ai却较模型显著降低。说明在ald的发生发展过程中，五田保肝液可通过抑制肝细胞的凋亡，起到保肝护肝的作用，而这种作用，具有剂量依赖性，以中、高剂量效果更加明显。

　　五田保肝液各组和易善复组随着tnfα、caspase3表达的下降，ai也随之降低，说明五田保肝液发挥抗肝细胞凋亡的机制可能和抑制tnfα、caspase3的高表达有一定关系。另外，易善复组caspase3 mrna的表达高于对照组，说明在某种程度上，五田保肝液中、高剂量抑制ald大鼠肝细胞凋亡的能力要强于易善复。但是五田保肝液低剂量组虽然tnfα、caspase3的表达比模型组低， ai却和模型组没有统计学差异，说明ald过程中，导致肝细胞凋亡的机制是十分复杂的，是受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径等调控的“瀑布”式激活过程。除了tnfα、caspase3凋亡这条信号通路发挥了重要作用，还有更为复杂的细胞因子网络的相互作用参与其中。

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