【摘要】 针对18ｏ同位素标记反应两个重要影响因素——肽段分散度和胰酶灭活方法，进行了标记条件的改进和灭活方法的优化。在h218ｏ中加入rapigesttm sf助溶剂并微波辅助加热，使α-酪蛋白胰酶酶切肽段的标记效率得到明显改进（18ｏ/16ｏ 峰面积比值>99%）。标记后，对胰酶进行还原烷基化化学修饰彻底灭活，使标记后的肽段稳定性显著提高，放置6 d不发生回交反应。对标准蛋白质甲状腺球蛋白酶切肽段混合物标记后的质谱实验结果表明：优化的标记方法能快速稳定地标记蛋白质酶切多肽。
【关键词】 18ｏ同位素标记；多肽；蛋白质组
peptide labeling with improved 18ｏ incorporation methodzhao yan，lu zhuang，jia wei，ying wan-ｔao，qian xiao-hong*(state key lab of proteomics，beijing proteome research center，beijing 102206(beijing institute of radiation medicine，beijing 100850)abstract in order to optimize the18ｏ labeling method，two key aspects，peptide dispersion and trypsin deactivation were discussed。 addition of rapigesttm sf in h218ｏ and microwave heating enhanced labeling efficiency of α-casein digested peptides(18ｏ/16ｏ ratio >99%).chemical modification with tris(2-carboxyethyl)phosphine(tcep) and iodoacetamide(iaa) resulted in trypsin deactivated significant back-exchange from 18ｏ to16ｏ was observed after labeling in 6 experiment result with peptide mixture from showed that the improved method could be effectively used to label protein and peptide.
keywords 18ｏ stable isotope labeling；peptide；proteome
1 引言
定量蛋白质组学通过批量观察正常与疾病细胞或组织在蛋白质表达谱上的差异，从整体水平上规模化筛选和发掘与疾病相关的蛋白，为致病机理研究和临床应用提供重要参考信息。18ｏ同位素标记技术是定量蛋白质组的一种常用技术 [1~5]。蛋白质酶切后的肽段，在胰蛋白酶的催化下，c-末端的两个16ｏ原子被替换成18ｏ原子，从而使质谱检测产生4 da的质量差异。通过比较标记肽段和未标记肽段的峰面积强度，得到一对蛋白样本的相对定量关系。尽管该标记反应具有条件温和，标记前后肽段的理化性质不发生改变，能和肽段的其它分离分析方法兼容等优点，但却由于反应条件极难控制，反应后标记产物不稳定而影响其在实验室的广泛应用。
本研究基于18ｏ同位素的标记原理，讨论了肽段分散度和胰酶灭活两个重要因素对标记的影响，并据此对方法进行了优化。相比文献[6]采用的水浴孵育标记和沸水加热灭活技术，本方法标记时间短，标记效率强，抑制回交反应。实验结果显示，即便对于复杂的多肽混合物体系，采用本方法也能获得高效的标记结果（18ｏ/16ｏ峰面积比值>99%）。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
4800基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪（maldi-tof-tof ms，美国applied biosystems公司）。
α-氰基4-羟基肉桂酸(chca)、甲状腺球蛋白、α-酪蛋白（美国sigma公司)；测序级胰蛋白酶(美国 promega公司)；97% h218ｏ(上海化工研究所)；三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（tcep，sigma公司）；碘乙酰胺(iaa，美国new jersey公司)；乙腈(公司)；三氟乙酸(tfa，acros公司)；rapigesttm sf（美国waters公司）。其它试剂为国产分析纯。
2.2 蛋白酶切
牛甲状腺球蛋白和α-酪蛋白蛋白用20 mmol/l nh4hco3溶解后，加入rapigesttm sf（终浓度 0.1%）和tcep（终浓度 5 mmol/l），在56 ℃还原1 h，再加入iaa （终浓度25 mmol/l）， 放置暗处还原1 h。加入胰酶-底物（1∶50，w/w）的trypsin酶切过夜。
2.3 蛋白标记和胰酶的灭活
将酶切后的肽段溶液冷冻干燥后直接加入h218ｏ重溶，混匀后放入微波中反应10 min。加入tcep（终浓度100 mmol/l）灭活，37 ℃水浴孵育1 h后，微波反应10 min。再加入iaa（终浓度100 mmol/l），于暗处放置1 h。
2.4 质谱分析
基质采用chca。仪器控制软件为4800 explorerｔｍ software，数据处理软件为gps explorerｔｍ software 2.0。一级质谱数据采集使用ms-1 kv反射模式，加速电压20 kv，扫描范围m/z 700~3500，激光能量4500，每张谱图累加1500次。马心肌红蛋白胰酶酶切肽段作为标准物对仪器进行外标校正，校准至误差≤0.1 da，相对标准偏差≤10×１０－６。
3 结果与讨论
3.1 增强蛋白质酶切肽段的标记效率
蛋白质酶切肽段18ｏ标记方法的原理是基于胰蛋白酶催化产生的两次酶-肽段复合物水解反应。该反应是快速的动态可逆反应。因此，经常发生标记效率不完全和标记肽段发生回交的情况， 有效地控制标记和回交抑制这两个环节是实验成功的关键[7，８]。
本实验通过改善肽段在反应体系中的分散程度和辅助加热，增加反应效率来有效地提高标记效率。肽段在体系中的分散程度增高后，有利于肽段c端的完全暴露，增加与胰酶和h218ｏ的接触机会。因此，改善肽段分散程度，能推进标记向正反应方向进行。在实验中，加入rapigesttm sf助溶剂，能增强蛋白质及多肽的溶解性，提高分散程度，有利于h218ｏ进行c末端羧基的交换反应。在α-酪蛋白酶切肽段18ｏ标记产物质谱分析结果中，因为加入rapigesttm sf助溶剂，m/z 1660，1267和2316的肽段的标记效率明显提高（图1a和图1d）。而未加入助溶剂组的3个肽段则标记不完全，仍然存在大量未标记的16ｏ肽段（图1c）。
图1 α-酪蛋白酶切肽段18ｏ标记前后maldi-tof-tof-ms质谱图（略）
fig.1 maldi-tof-tof-ms spectrum of tryptic digested peptides of α-casein
a.未标记的α-casein酶切肽段质谱图(spectrum of unlabeled peptide mixture)；b.m/z 1267，1660和2316的肽段标记前质谱图(spectrum of unlabeled peptides with m/z of 1267，1660 and 2316)； c.m/z 1267，1660和2316的肽段未加rapigesttm sf，孵育过夜标记后的质谱图(spectrum of labeled peptides with m/z of 1267，1660 and 2316 without rapigesttm sf，at 37 ℃ for 24 h)； d.m/z 1267，1660和2316的肽段加入rapigesttm sf，孵育过夜标记后的质谱图(spectrum of labeled peptides with m/z of 1267，1660 and 2316 with rapigesttm sf，at 37 ℃ for 24 h)； e.质荷比为1267，1660和2316的肽段加入rapigesttm sf，微波加热10 min标记的质谱图(spectrum of labeled peptides with m/z of 1267,1660 and 2316 with rapigesttm sf and microwave heating for 10 min)。
常规方法中，18ｏ标记需要在37 ℃水浴中孵育24 h,以达到充分反应的目的。但即便如此，温和的反应条件和较长的反应时间也难以保证标记完全。蛋白质酶切加上标记所耗费的时间超过36 h，滞后了实验的进程。并且由于长时间置于水浴环境，容易因为密封不严等情况引入h216o，从而导致标记不完全。本实验采用微波加热的方式，不仅隔绝了潮湿的环境，而且只需要10 min即可标记完全。质谱结果见图1d和图1e。与传统的水浴加热方法相比，由于微波使肽段的受热更为快速和均匀，因此能在很短时间内达到理想的标记效果。
3.2 标记肽段回交的抑制
18ｏ标记反应的另一个常见问题是标记肽段容易发生回交。由于该标记反应是一种可逆反应，因此如果将18ｏ标记完全的肽段溶于h216o中，仍能使18ｏ标记肽段回复到16ｏ标记状态。胰酶是造成回交的主要因素，目前文献报道抑制回交的方法有酸中止法、超滤胰酶法和微波胰酶灭活法，都不能完全抑制胰酶的活性，置于h216o中仍能发生一定程度的回交[7]。本研究采用化学灭活法，通过高浓度的还原试剂和烷基化试剂，对溶液中残留的胰酶彻底灭活。如图2所示，胰酶灭活后，18ｏ标记肽段在液相色谱流动相（2%乙腈-98%水-0.5%甲酸）中保存6 d仍没有观察到明显的回交产物，稳定的标记肽段能在液相色谱中进行后续分离分析。
图2 18ｏ标记后的α-酪蛋白酶切肽段在2%乙腈-98%水-含0.5%甲酸溶液中稳定性考察（略）
fig.2 stability of labeled α-casein peptides in 2% acn-98% water-0.5% formic acid(fa) solution
a． α-酪蛋白酶切肽段标记后maldi-tof-tof质谱图(maldi-tof-tof-ms spectrum of labeled α-casein)；α-casein酶切肽段m/z 1267，1660 和2316标记后的maldi-tof-tof质谱图(after labeling maldi-tof-tof-ms spectrum of labeled α-casein peptides m/z 1267，1660 and 2316) : b.0 d；c.1 d；d.3 d；e.6 d。
3.3 复杂肽段混合物标记结果
牛甲状腺蛋白分子量为660 kda。酶切后maldi-tof-tof质谱能检测到其中24条肽段。将优化后的方法用于该蛋白质酶切肽段的标记，以考察方法在复杂肽段混合物中应用的有效性和耐受性。结果如图3所示， 本方法对于复杂肽段混合物仍能产生令人满意的标记效率。
图3 牛甲状腺球蛋白酶切肽段18ｏ标记效率图（标记效率计算用18ｏ标记肽段的单同位素质谱峰面积与16ｏ肽段的单同位素峰面积比值）（略）
fig.3 labeling efficiency of thyroglobin peptides with 18ｏ(18ｏ incorporation efficiency was calculated by 18ｏ/16ｏ ratio of the first isotopic peak area)
３．４ 小结
18ｏ标记反应是定量蛋白质组学中应用最为广泛的同位素标记方法之一。但由于该反应是一种动态可逆反应，18ｏ交换受到多种因素影响，标记效率和抑制回交一直是实验过程中的棘手问题， 目前仍不能稳定地在多个实验室广泛应用[9，１０]。本研究在标记和抑制回交两个关键点上对18ｏ标记方法进行了优化。通过增强肽段的分散度，改变辅助加热方式，结合化学方法彻底灭活胰酶，阻断回交反应的发生，减少了标记时间，标记效率显著提高，增强了标记产物的耐用性，满足差异蛋白质组分析的需要。
【参考文献】
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