强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性进行性自身免疫性疾病,其病变并非局限于关节,多引起关节以外的结缔组织的病变。肺脏因富含丰富的结缔组织与血管,很容易受累。前瞻性研究表明,AS肺部受累发生率达1.5%~30.0%[1]。
一般认为其发病与感染、遗传和免疫有关,但确切发病机制至今尚未明确。近年来研究表明,氧化应激(oxidative stress,OS)可能在AS相关的肺脏疾病发生、发展中起重要作用。
研究发现,核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)通过与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)相互作用调节编码抗氧化蛋白,是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路。Kelch样ECH相关蛋白l(Kelch-like ECH-associated protein1,
Keap1)-Nrf2-ARE作为机体内有效的抗氧化调节通路,对于防御、减轻氧化应激对人体的危害起着举足轻重的作用[2-3]。
Nrf2广泛存在于多种组织和细胞中,在调节氧化应激反应中起重要作用。正常情况下,Keap1将Nrf2以二聚体形式锚定于胞浆,促使胞浆内Nrf2持续泛素化并被蛋白酶不断降解,从而抑制Nrf2激活[4]。应激状态下,活性氧、活性氮和内外源性电子激活剂可氧化Keap1上的巯基或磷酸化Nrf2分子中的丝氨酸和苏氨酸残基,从而改变Keap1或Nrf2空间构象,抑制Keap1活性,导致Nrf2与Keap1分离,向细胞核内转移;在核内,Nrf2与小分子Maf蛋白结合形成二聚体,然后再与ARE结合,启动下游抗氧化酶基因及II相解毒酶基因转录,从而调节细胞氧化还原状态,抵抗氧化应激和其他毒性损伤,实现其抗氧化和解毒作用[5-7]。
Keap1-Nrf2-ARE信号通路的活化,是机体对环境毒物的一种应激防御反应能力的体现。
国外诸多研究表明,氧化水平升高和抗氧化能力下降可能与AS的发病有关[8-10],但AS关节外病变肺功能的变化是否与氧化应激紊乱有关?迄今为止未见相关文献报道。Keap1-Nrf2-ARE作为机体内最为重要的内源性抗氧化应激通路,在AS肺功能损伤中扮演着何种角色尚不清楚。故本次研究我们先假设Keap1-Nrf2-ARE通路活化是AS患者肺功能降低的作用机制(简明机制示意图见图1),然后通过观察AS患者肺功能Keap1-Nrf2-ARE的变化,并将肺功能变化与Keap1-Nrf2-ARE通路指标进行相关性分析,旨在说明Keap1-Nrf2-ARE通路在AS患者肺功能降低中的作用,探讨肺功能降低的作用机制。
1 研究对象
选取2012年9月至2013年10月在本院就诊的AS患者120例,设为AS组,男90例,女30例,男∶女为3∶1;年龄18~60岁,平均(30.6±9.4)岁;病程1~24年,平均(9.2±7.5)年。所有患者均符合1984年美国风湿病学会(ACR)修订的纽约诊断标准[11]并参考2009年3月ASAS发布的中轴型SPA分类标准[12]。另设60例正常对照(NC)组,男45例,女15例,男∶女为3∶1,年龄20~54岁,平均(28.6±10.8)岁,均来自本院体检中心,经体检和免疫学检查排除自身免疫性疾病,均为身体健康、无明显器质性疾病者。两组在性别、年龄等方面比较,差异无统计学意义(P > 0.05),具有可比性。本研究方案已通过本院伦理审查委员会审批,所有受试者均签署知情同意书。
2 观察指标及方法
2.1 肺功能测定 采用德国Jager MasterScreen自动肺功能检测仪测定AS患者肺功能,测定前患者禁止吸烟2周。测定项目包括:用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积(FEV1)、最大通气量(MVV)、最大呼气流量(PEF)、25%肺活量位的最大呼气流量(FEF25)、50%肺活量位的最大呼气流量(FEF50)、75%肺活量位的最大呼气流量(FEF75)。为了消除性别、年龄、身高、体质量等因素对肺功能测定值的影响,以上参数均以实测值/正常预计值(%)表示,肺功能各指标皆以实测值/正常预计值< 80%为异常。
2.2 氧化应激指标测定 取患者血清10 mL,置
3 000 r·min-1离心机离心15 min,分离后进行4等
份分装,-80 ℃冷冻保存统一检测。所有指标均参照试剂盒说明书进行操作。参照标准曲线计算标本相应指标的测定值。采用酶联免疫分析法(ELISA法)检测AS组和NC组血清中通路蛋白(Keap1、Nrf2)、氧化应激指标[丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(TAOC)]、细胞因子(IL-18、TNF-α、IL-4、IL-35)含量。Keap1、
Nrf2试剂盒购自美国Millipore公司;MDA、ROS、RNS、SOD、CAT、TAOC试剂盒购自南京建成生物工程研究所;IL-18、TNF-α、IL-4、IL-35试剂盒购自英国伯明翰公司。
2.3 实验室指标测定 所有被选对象均于清晨空腹时静脉采血10 mL,采集后标本立即送往本院实验中心检测,检测指标主要有:ESR、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、IgG、IgA、IgM。检测方法:ESR用魏氏法,以mm·h-1表示;hs-CRP、IgG、IgA、IgM用日立7 060型全自动生化分析仪进行测定,以mg·L-1表示。
2.4 主要症状、体征积分量化评分标准 参照国家食品药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》[13],将具体的关节症状体征、肺功能症状换算成积分值。
2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。为连续性变量的实验数以表示,样本均采用Kolmogorov-Smirnov正态性检验;计量资料采用t检验;计数资料采用χ2检验;采用Spear-
man软件进行相关性分析。以P < 0.05或P < 0.01
为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 两组肺功能变化检测结果 120例AS患者,
肺功能参数一项指标异常率为58.33%,肺功能参数二项指标异常率49.17%,肺功能参数三项指标异常率38.33%,肺功能参数四项指标异常率24.17%,肺功能参数五项指标异常率8.33%,肺功能参数六项指标异常率5.00%,肺功能参数七项指标异常率1.67%。见图2。与60例NC组肺功能异常率比较,AS组肺功能异常率为58.33%,NC组异常率为5.00%。见表1。
3.2 两组肺功能参数、氧化应激指标、细胞因子、炎症指标的比较 与NC组比较,AS组患者FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75值及SOD、CAT、TAOC值均显著降低(P < 0.01或P < 0.05);Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA值显著升高(P < 0.01
或P < 0.05);IL-18、TNF-α、ESR、CRP值显著升高(P < 0.01);IL-4、IL-35值显著降低(P < 0.01或P < 0.05)。见表2。
3.3 AS患者外周血Keap1、Nrf2异常者肺功能变
化 以60例NC组外周血Keap1、Nrf2数值统计正常值区间,Keap1(1.56~8.04 ng·mL-1)、
Nrf2(1.98~10.10 ng·mL-1),筛选出AS患者Keap1、Nrf2异常组别。与Keap1正常组比较,Keap1
异常组FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75值降低;与Nrf2正常组比较,Nrf2异常组FEV1、MVV、PEF、FEF25、FEF50、FEF75值降低(P < 0.05或P < 0.01)。与Nrf2异常组比较,Keap1异常组FEV1、PEF、FEF50、FEF75值降低(P < 0.05)。见表3。
3.4 AS患者外周血Keap1和Nrf2表达与氧化应激指标、细胞因子、肺功能症状等指标的相关分析
Spearman相关性分析结果显示,AS患者外周血Keap1表达与ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、CRP、胸闷及气短症状呈正相关(P < 0.05或P < 0.01);与SOD、TAOC、IL-4、IL-35呈负相关(P < 0.05或P < 0.01)。AS患者外周血Nrf2 表达与SOD、CAT、IL-4、IL-35呈负相关(P < 0.05或P < 0.01);与ROS、RNS、MDA、胸闷症状呈正相关(P < 0.05或P < 0.01)。见表4。
3.5 AS患者肺功能参数与氧化应激指标、症状体征积分等指标的相关分析 Spearman相关性分析显示,FEV1与SOD、CAT、TAOC、IL-4、IL-35呈正相关,与Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、CRP、胸闷、气短、呼吸困难呈负相关;MVV与SOD、TAOC、IL-4、IL-35呈正相关,与Keap1、Nrf2、ROS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、胸闷、气短呈负相关;PEF与SOD、CAT、IL-4呈正相关,与Keap1、Nrf2、ROS、IL-18、胸闷、脊柱疼痛呈负相关;FEF50与SOD、CAT、TAOC、IL-4呈正相关,与Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、胸闷、气短呈负相关;FEF75与SOD呈正相关,与Keap1、ROS、RNS、胸闷呈负相关(P < 0.05或P < 0.01)。见表5。
4 讨 论
AS是以骶髂关节和脊柱中轴关节慢性炎症为主的自身免疫性疾病,临床上若延误诊治,易引起关节以外的结缔组织的病变[14]。肺脏因含丰富的结缔组织与血管,因此很容易受累。AS患者肺脏受累可表现为肺上部囊性纤维化、胸膜病变、肺血管炎等,这些病理改变导致了肺功能的变化。自由基是机体内很强的氧化反应能力的分子、离子、原子或原子团,当自由基过度产生或机体的抗氧化防御体系功能受损时,机体将处于氧化应激状态,从而导致组织细胞损伤[15]。
肺功能变化直接表现为FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75降低。肺功能参数FVC、FEV1、MVV、PEF主要反映的是通气功能,而参数FEF25、FEF50、FEF75反映的是小气道的功能。本研究结果显示,58.33%的AS患者存在肺功能降低,与NC组比较,AS患者FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75值均显著降低(P < 0.01或
P < 0.05)。即AS患者肺功能降低主要表现为通气功能降低,并伴有不同程度的小气道通气障碍。与NC组比较,AS患者血清中SOD、CAT、TAOC值均显著降低(P < 0.01或P < 0.05);ROS、RNS、MDA值显著升高(P < 0.01或P < 0.05)。ROS、RNS、MDA是反映机体氧化水平的关键指标;而SOD、CAT、TAOC是反映机体抗氧化水平的关键指标。本研究发现肺功能降低的AS患者存在氧化应激紊乱,处于氧化水平升高和抗氧化能力明显下降的状态。与NC组比较,AS患者IL-18、TNF-α、ESR、CRP值显著升高(P < 0.01),IL-4、IL-35值显著降低(P < 0.01或P < 0.05)。IL-18、TNF-α属于致炎细胞因子[16],而IL-4、IL-35属于抗炎细胞因子[17],ESR、CRP可反映疾病的活动程度。本研究发现肺功能降低的AS患者处于疾病活动状态且存在细胞因子失衡,炎性细胞因子含量明显升高。与NC组比较,肺功能降低的AS患者Keap1、Nrf2表达上升。这表明肺功能降低的AS患者存在Keap1-Nrf2-ARE通路的活化。
为进一步验证Keap1-Nrf2-ARE通路在AS患者肺功能降低中的影响,本研究发现,与AS患者外周血Keap1、Nrf2正常组比较,Keap1、Nrf2异常组肺功能参数FEV1、MVV、PEF、FEF50、FEF75值降低。提示AS患者外周血Keap1、Nrf2升高会直接或间接导致肺功能降低。
本研究通过相关分析得知,肺功能降低的AS患者FEV1与SOD、CAT、TAOC、IL-4、IL-35呈正相关,与Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、CRP、胸闷、气短、呼吸困难呈负相关;MVV与SOD、TAOC、IL-4、IL-35呈正相关,与Keap1、Nrf2、ROS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、胸闷、气短呈负相关;PEF与SOD、CAT、IL-4呈正相关,与Keap1、Nrf2、ROS、IL-18、胸闷、脊柱疼痛呈负相关;FEF50与SOD、CAT、TAOC、IL-4呈正相关,与Keap1、Nrf2、ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、胸闷、气短呈负相关;FEF75与SOD呈正相关,与Keap1、ROS、RNS、胸闷呈负相关。而AS患者外周血Keap1表达与ROS、RNS、MDA、IL-18、TNF-α、ESR、CRP、胸闷及气短症状呈正相关(P < 0.05或P < 0.01);与SOD、TAOC、IL-4、IL-35呈负相关(P < 0.05或P < 0.01)。
AS患者外周血Nrf2 表达与SOD、CAT、IL-4、IL-35呈负相关(P < 0.05或P < 0.01);与ROS、RNS、MDA、胸闷症状呈正相关(P < 0.05或P < 0.01)。
这提示Keap1、Nrf2的水平与AS疾病活动状态、氧化应激状态、细胞因子平衡、肺功能参数明显相关,当体内ROS、RNS等氧化指标含量升高时,Keap1、Nrf2表达上升,Keap1-Nrf2-ARE信号通路活化后,抗氧化指标SOD、CAT、TAOC含量下降,机体抗氧化能力降低,促使细胞因子失衡,IL-18、TNF-α等促炎细胞因子含量升高,而IL-4、IL-35等抑炎细胞因子含量降低,ESR、CRP等疾病活动性指标升高,导致免疫复合物异常沉积增多,引起AS发病;若免疫复合物异常沉积于肺组织,使肺组织小血管基底膜出现血管炎改变,从而损害肺毛细血管结构,致使肺组织或器官受到损伤或破坏,肺毛细血管有效血流量降低,肺功能出现限制性或混合性通气功能障碍,肺功能降低。
本研究结果与研究前假说基本一致(见图3),鉴于以上研究结果,我们可以认为氧化应激可能参与了AS患者肺功能降低的发生与发展,Keap1-Nrf2-ARE信号通路的活化可能是AS患者肺功能降低的机制。
5 参考文献
[1]蒋明,朱立平,林孝义.风湿病学[M].北京:科学出版社,1995:941-964.
[2]Yu X,Kensler 2 as a target for cancer chemo-prevention[J].Mutat Res,2005,591(1-2):93-102.
[3]Thimmulappa RK,Lee H,Rangasamy T,et 2 is a critical regulator of the innate immune response and survival during experimental sepsis[J].J Clin Invest,2006,116(4):984-995.
.Cancer Res,2008,68(2):364-368.
.J Physiol,
2011,589(17):4125-4136.
.Toxicol Appl Pharm,2010,244(1):37-42.
[7]Boutten A,Goven D,Artaud-Macari E,et 2 targeting: a promising therapeutic strategy in chronic obstructive pulmonary disease[J].Trends Mol Med,2011,17(7):363-371.
.Clinical Rheumatology,2010,29(3):303-307.
.Rheumatology international,2007,27(12):1131-1134.
[10]刘磊,刘健,冯云霞,等.强直性脊柱炎患者血清超氧化物歧化酶的变化及相关因素分析[J].中国临床保健杂志,2012,15(5):478-481.
[11]陆再英,钟南山.内科学[M].7版.北京:人民卫生出版社,2008:867-868.
[12]中华医学会风湿病学分会.强直性脊柱炎诊断及治疗指南[J].中华风湿病学杂志,2010,14(8):557-559.
[13]国家食品药品监督管理局.中药新药临床研究指导原则[M].北京:中国医药科技出版社,2002:
123.
[14]王新卫,林智明,廖泽涛,等.IL-23与IL-17在强直性脊柱炎患者中表达的初步研究[J].中国免疫学杂志,2009,25(3):266-270.
.Rheumatology, 2004,43(10):1235-1239.
[16]罗心静,莫选荣,周玲玲.TNF-α诱导类风湿关节炎滑膜细胞NF-κB信号通路活化的探讨[J].免疫学杂志,2012,28(4):321-323.
[17]左阳花,苏兆亮,王胜军,等.子宫内膜异位症患者血清IL-4/IFN-γ和TGF-β/IL-17的变化及意义[J].免疫学杂志,2011,27(10):883-885.
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