摘要:目的探讨姜黄素衍生物C212对白血病细胞的周期阻滞和诱导凋亡作用。方法K562细胞分为低、中、高剂量实验组和对照组(分别含1.5，3.0，4.5和0μmol·L－1姜黄素衍生物C212)，HL－60细胞分为低、中、高剂量实验组和对照组(分别含0.8，1.6，2.4和0μmol·L－1姜黄素衍生物C212)。用噻唑蓝法检测细胞的生长抑制率，用流式细胞术检测线粒体膜电位与细胞周期，用蛋白质印迹法检测p53、p21和p27的表达水平。结果姜黄素衍生物C212对K562细胞24，48和72h的半抑制浓度(IC50)分别为(12.47±0.19)，(3.63±0.06)和(2.00±0.07)μmol·L－1;对HL－60细胞24，48和72h的IC50分别为(1.84±0.08)，(1.07±0.03)和(0.76±0.01)μmol·L－1。与对照组相比，4.5μmol·L－1姜黄素衍生物C212作用于K562细胞1，2和3h后，膜电位耗散的细胞从(2.43±0.78)%依次增加到(6.73±0.60)%，(18.30±0.54)%，(31.87±0.83)%;2.4μmol·L－1姜黄素衍生物C212作用于HL－60细胞1，2和3h后，绿色荧光部分细胞所占百分比比例从(2.27±0.57)%增加至(9.07±0.69)%，(15.37±0.77)%，(26.87±0.91)%。干预24h后，低、中、高剂量实验组分别有(10.71±2.46)%，(25.45±2.10)%，(24.84±2.11)%的K562细胞和(13.85±2.12)%，(18.03±3.07)%，(21.40±1.94)%的HL60细胞阻滞于G2/M期。姜黄素衍生物C212剂量依赖性地上调周期调控蛋白p53、p27和p21蛋白的表达水平。结论C212一方面通过诱导白血病细胞线粒体膜电位的耗散，促使细胞凋亡;另一方面，可通过上调周期负调控蛋白水平，阻滞细胞周期，抑制白血病细胞的增殖。
关键词:姜黄素衍生物C212;抗白血病;增殖抑制;线粒体膜电位
白血病是一类起源于造血干细胞恶性克隆性疾病［1］。姜黄素及其衍生物能够明显抑制白血病细胞的生长［2－3］。本实验室发现一种新型的姜黄素衍生物C212可明显抑制K562和HL－60细胞的增殖。本研究旨在探讨姜黄素衍生物C212对白血病细胞的周期阻滞和诱导凋亡作用。
1材料与方法
1材料药品与试剂姜黄素衍生物C212，纯度:＞95%，本课题组对姜黄素进行结构改造合成。四甲基偶氮唑盐(MTT)、碘化丙啶(PI)，均购自美国Sigma公司;JC－1细胞线粒体膜电位检测试剂盒，南京凯基生物公司生产;β－actin单克隆抗体，美国SantaCruz公司生产;抗p21、p53等一抗，均为美国CST公司生产;BCA蛋白定量试剂、辣根过氧化物酶(HＲP)标记的羊抗鼠/兔免疫球蛋白G(IgG)二抗，均为美国Pierce公司生产。仪器CX31P－OC－1普通光学显微镜，日本Olympus公司产品;MicroplateＲeader450酶标仪、EPS600稳压稳流电泳仪，均为美国Bio－Ｒad公司产品;FACSCantoⅡ流式细胞仪，美国BD公司产品;免疫印迹成像系统，美国Carestream公司产品。细胞株人慢性粒细胞白血病细胞K562细胞，人急性粒细胞白血病细胞HL－60细胞，均购自中科院上海细胞研究所。
2实验方法
2.1细胞培养［4］K562和HL－60细胞培养在含10%胎牛血清、青霉素100U·mL－1和链霉素100μg·mL－1(1%双抗)的ＲPMI1640培养液中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于开展本实验研究。2.2细胞分组与给药方法25.00，12.50，6.25，3.13，1.56，0.78和0μmol·L－1姜黄素衍生物C212分别作用于K562细胞和HL－60细胞24，48和72h，用于检测姜黄素衍生物C212对细胞的生长抑制作用。将4.5和2.4μmol·L－1姜黄素衍生物C212(高剂量实验组)分别作用于K562细胞和HL－60细胞1，2和3h，并设置未加药空白对照组，用于检测姜黄素衍生物C212对线粒体膜电位的影响。将K562细胞分为低、中、高剂量实验组和对照组(分别含1.5，3.0，4.5和0μmol·L－1姜黄素衍生物C212处置)，HL－60细胞分为低、中、高剂量实验组和对照组(分别含0.8，1.6，2.4和0μmol·L－1姜黄素衍生物C212处置)，作用24h后，检测姜黄素衍生物C212对细胞周期及周期调控蛋白表达的影响。2.3观察指标2.3.1用MTT法检测C212对K562和HL－60细胞的增殖抑制作用［4］取对数生长期K562细胞和HL－60细胞，稀释至4×104cell·mL－1，接种于96孔板，每孔180μL，分别加入25.00，12.50，6.25，3.13，1.56和0.78μmol·L－1的姜黄素衍生物C21220μL作为实验组及相同浓度的二甲基亚砜(DMSO)作为对照组，设置背景对照，每组均设定3个平行孔。药物作用24，48和72h后，每孔加入5mg·mL－1MTT20μL，于37℃继续孵育4h，以8000r·min－1离心5min，弃上清液，每孔加入DMSO150μL，震荡10min，甲臜溶解后，于570nm处测定光密度(OD)值。细胞生长抑制率=(OD对照组－OD实验组)/(OD对照组－OD背景孔)×100%。2.3.2用JC－1染色检测C212对K562和HL－60细胞线粒体膜电位的影响［5］细胞分组和给药方法同“2.2”，以1000r·min－1离心5min，收集细胞，重悬于1×IncubationBuffer500μL，37℃孵育20min。离心后，弃上清液，1×Incuba-tionBuffer洗2次，1×IncubationBuffer500μL重悬后转移至流式管，4℃避光保存，在60min内上机检测，JC－1是线粒体膜电位依赖性探针，线粒体膜电位正常时，其富集于线粒体以多聚体形式存在，发红色荧光;当线粒体膜电位耗散时，JC－1以低聚体形式存在，发绿色荧光。JC－1红绿荧光的比值变化反应C212对线粒体膜电位的影响。2.3.3用碘化丙啶(PI)染色检测C212对白血病细胞的细胞周期的影响［6］细胞分组和给药方法同“2.2”，以1000r·min－1离心5min，收集细胞，重悬于预冷的75%的乙醇5mL中，在－20℃下，固定24h。以5000r·min－1离心5min，弃上清液，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗1遍，将细胞重悬于PI染色液(50μg·mL－1)，于室温避光染色30min。将其转移至流式管中，于4℃避光，保存在冰上，并在流式细胞仪上检测。2.3.4用蛋白质印迹法检测C212对p53、p21和p27蛋白水平的影响［4］细胞分组和给药方法同“2.2”，收集细胞，用ＲIPA冰上裂解30min，以1.2×104r·min－1离心5min，收集上清细胞裂解液，进行BCA定量后，进行DSA－PAGE分离蛋白样品后，经5%脱脂奶粉封闭1h，1×TBST洗3遍，4℃一抗孵育过夜，1×TBST洗3遍，HＲP－IgG室温孵育1h，1×TBST洗3遍后，进行显影。
3统计学处理
用GraphPadPrism软件和Origin8.5软件进行One－wayanalysisofvariance实验数据分析。结果用x珋±s表示。结果1C212对K562和HL－60细胞的时量效关系随着时间延长，黄素衍生物C212对K562和HL－60细胞的抑制率逐渐增加，其对白血病细胞的增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性，其中6.25μmol·L－1黄素衍生物C212作用于K562和HL－60细胞24，48和72h后，抑制率分别为(37.05±0.48)%，(59.61±1.66)%，(67.02±0.72)%和(63.63±1.23)%，(80.76±0.45)%，(90.43±1.73)%。黄素衍生物C212对K562和HL－60细胞24，48和72h的半抑制浓度(IC50)分别为(12.47±0.19)，(3.63±0.06)，(2.00±0.07)μmol·L－1和(1.84±0.08)，(1.07±0.03)，(0.76±0.01)μmol·L－1，且HL－60细胞对黄素衍生物C212更加敏感，具有比K562更低的IC50。结果见图1。2姜黄素衍生物C212诱导线粒体膜电位的耗散4.5μmol·L－1姜黄素衍生物C212作用于K562细胞1，2和3h及空白对照组的绿色荧光部分细胞所占百分比分别为(6.73±0.60)%，(18.30±0.54)%，(31.87±0.83)%和(2.43±0.78)%;2.4μmol·L－1姜黄素衍生物C212作用于HL－60细胞1，2和3h及空白对照组的绿色荧光部分细胞所占百分比分别为(9.07±0.69)%，(15.37±0.77)%，(26.87±0.91)%和(2.27±0.57)%。与空白对照组相比较，高剂量实验组能够快速耗散白血病细胞的线粒体膜电位，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。3各组白血病细胞(K562和HL－60)细胞周期比较随着姜黄素衍生物C212浓度的不断增加，G2/M期的K562和HL－60细胞比例也明显随之增加，差异均有统计学意义(均P＜0.05)，细胞被阻滞在G2/M期，见表1。4各组白血病细胞K562中p53、p21和p27蛋白表达水平的比较1.5，3.0，4.5μmol·L－1组和空白对照组白血病细胞p53蛋白相对表达量分别为0.69±0.04，0.66±0.03，0.72±0.02和0.38±0.02，p27蛋白相对表达量分别为0.60±0.03，0.73±0.03，0.92±0.05和0.33±0.02，p21蛋白相对表达量分别0.60±0.01，0.97±0.06，1.02±0.02和0.29±0.01。与空白对照组相比较，实验组K562细胞中p53、p21和p27的水平均显著性增加，呈剂量依赖性(均P＜0.05)。结果见图2。讨论在细胞凋亡的早期表现中，可以观察到因线粒体膜的破裂，各种离子自由通过线粒体膜，使膜电位发生变化，细胞色素C(Cyt－C)被释放进入细胞质中，激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡。研究显示，姜黄素衍生物C212能够引起白血病细胞线粒体膜电位的耗散，预示着其可能诱导白血病细胞凋亡。据相关文献报道，诱导细胞的衰老在抑制癌症发生发展的初期具有重要意义［7］。p53/p21通路在调控细胞周期进展和细胞衰老中表现出重要作用［8］。p53蛋白是重要的抑癌因子之一，参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡及DNA损伤等重要过程［9］。p21基因是p53关键的下游靶标分子之一，能调控肿瘤细胞衰老的起始。p21与p53共同组成细胞周期检查点，能降低受损伤DNA复制的机会，进而发挥抑癌作用。p53和p21蛋白在白血病细胞中的总表达率可达50%，所以，同时调控2种蛋白水平可以提高预测白血病预后的价值。另外，p27蛋白对细胞增殖的负调控的生物学功能，提示其可能作为一个抑癌候选基因，并且有报道说明了p27与白血病有着相关密切的联系［10］。本实验结果显示，姜黄素衍生物C212能够上调p53、p21和p27的表达，使受损伤的DNA不能进入复制状态，导致细胞周期阻滞，姜黄素衍生物C212可能通过诱导白血病细胞的衰老来抑制增殖。
作者：沈云珠 刘碧 黄晓威 许建华
