摘要目的：探讨二至丸合桂枝汤对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系顺铂耐药性的影响及其分子机制作用。方法：设计并合成3条缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）siRNA，分为1#siRNA组、2#siRNA组、3#siRNA组、阴性对照组及Control组分别转染，Westernblot筛选最适siRNA。同时利用药物连续诱导法筛选顺铂耐药性MDA-MB-231细胞株(MDA-MB-231/CDDP)。制备含二至丸合桂枝汤血清，MDA-MB-231/CDDP细胞株随机分为A：空白组(转染siRNA阴性对照)、B：HIF-1αsiRNA组、C：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤组(200µg/ml含药血清)、D：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤(200µg/ml)+顺铂(10μmol/L)组，继续培养，检测细胞活性、细胞凋亡及细胞侵袭情况。同时利用qRT-PCR和Westernblot分别检测各组细胞中血管内皮生长因子（VEGF）、HIF-1αmRNA及蛋白表达情况。结果：3#siRNA组HIF-1α蛋白表达水平抑制最显著，选此siRNA用于后续研究。与A组相比，C组和D组在作用24h、48h后均可显著抑制MDA-MB-231/CDDP细胞活性(P＜0.05或P＜0.01)，细胞凋亡率显著升高(P＜0.01)，且能显著抑制细胞侵袭能力(P＜0.05或P＜0.01)，其中，D组作用效果最显著。qRT-PCR和Westernblot检测结果显示二至丸合桂枝汤与顺铂联合干预，可显著下调MDA-MB-231/CDDP细胞中VEGF、HIF-1ɑmRNA及蛋白表达。结论：二至丸合桂枝汤可通过抑制HIF-1α通路，下调VEGF表达，调控TNBC细胞系的顺铂耐药性。
关键词：三阴性乳腺癌；二至丸；桂枝汤；顺铂耐药性
HIF-1α通路三阴性乳腺癌（TNBC）靶向及内分泌治疗效果不佳，新辅助化疗方案对TNBC具有较高的缓解率和良好的预后，顺铂为首选化疗药物之一，但存在顺铂耐药性，逆转顺铂耐药性是有效治疗TNBC的潜在策略。缺氧诱导因子l（HIF-1）可促进肿瘤增殖和血管新生；HIF-1α功能性亚基与HIF-1活性水平密切相关。二至丸合桂枝汤可介导HIF-1α对TNBC细胞顺铂耐受机制进行调控，但其机制仍未阐明。基于此，本研究利用HIF-1αsiRNA转染顺铂耐药性MDA-MB-231（MDA-MB-231/CDDP）细胞株，深入探讨二至丸合桂枝汤介导HIF-1通路对TNBC细胞系顺铂耐药性的调控机制，以期为二至丸合桂枝汤的临床推广应用提供坚实的理论基础。
1材料与方法
1.1实验动物与细胞：健康SPF级SD大鼠，体质量200±30g[购于上海斯莱克动物实验有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0015]，饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心，动物使用SYXK许可证号为(浙)2020-0024。适应喂养1周。转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(货号：iCell-h133，赛百慷)，于含青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、5%胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)的DMEM培养基培养，置于恒温培养箱中(37ºC，含5%CO2)。1.2实验试剂与仪器：二至丸合桂枝汤(女贞子、旱莲草各10g，桂枝、芍药、生姜各9g，炙甘草6g，大枣12枚，水煎至300ml，浓缩至1g/ml)。FBS(货号：11011-8615，浙江天杭生物科技)；DMEM高糖培养基(货号：SH30243.01，Hyclone)；CCK-8试剂盒(货号：HY-K0301，MCE)；细胞凋亡试剂盒(货号：556547，BD)；BCA蛋白定量试剂盒(货号：pc0020，Solarbio)。HIF-1α、血管内皮生长因子（VEGF）、GAPDH抗体(货号：AF1009、AF5131、AF7021，Affinity)。CMaxPlus酶标仪(MD)；Micro17R低温高速离心机(Thermo)；C6流式细胞仪(BD)；LightCy-cler®96实时荧光定量PCR(罗氏)；NanodroponemRNA定量仪(ThermoScientific)。1.3HIF-1αsiRNA设计、转染与分组：合成三条Gan-kyrinsiRNA和一条对照siRNA，具体序列如下：1#siRNA组(5'-GCUGGAGACACAAUCAUAUTT-3’)；2#siRNA组(5'-AGGAAGAACTATGAACATAAA-3')；3#siRNA组(5'-TACGTTGTGAGTGGTATTATT-3')；阴性对照组(5'-UUCUCC-GAACGUGUCACGUTT-3')。将HIF-1αsiRNA和Lipo-fectamine™2000转染试剂在OptiMEM介质中按照siRNA∶聚合物为1∶1(w/w)制备复合物。在50nMsiRNA浓度下向细胞中加入配合物；细胞在50%～60%融合时转染siRNA复合物。同时设置Control组，不做处理。1.4MDA-MB-231/CDDP细胞株建立：顺铂连续诱导法筛选耐药细胞株。MDA-MB-231细胞系取对数生长期接种于DMEM培养液(含顺铂+10%FBS)，0.01、0.1、0.5、1、5、10μmol/L的顺铂逐渐诱导，48h后换培养液，每2～3d传代1次，诱导6个月获得细胞株。1.5制备二至丸合桂枝汤血清：20只SD大鼠随机分为两组，正常组：蒸馏水；给药组：8.5g·kg-1·d-1二至丸合桂枝汤，灌胃7d。腹主动脉收集5ml血标本，合并清液，灭活。微孔滤膜滤过，于－80℃冰箱保存。1.6给药处理实验分组：MDA-MB-231/CDDP细胞株在10%FBS的DMEM高糖培养基培养。细胞随机分为A：空白组(转染siRNA阴性对照)、B：HIF-1αsiRNA组、C：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤(200µg/ml含药血清)组、D：HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤(200µg/ml)+顺铂(10μmol/L)组，培养48h。1.7Westernblot：分离目标蛋白，SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，先后加一抗和二抗孵育，免疫印迹反应结束后，化学发光仪显影。1.8CCK-8检测：根据“1.6”细胞分组，培养对数生长期细胞悬液，加入10μl/孔CCK-8试剂，而后于450nm处测定吸光度值，计算细胞活性。1.9流式细胞术：于6孔板接种对数生长期细胞，细胞浓度调至1×106/ml。添加500μl结合缓冲液，上清液离心并添加100μl结合缓冲液。之后分别加入5μl和10μlPI的膜AnnexinV-FITC。室温下反应15min，加入400μl结合缓冲液，1h内检测细胞凋亡率。重复3次。1.10Transwell细胞侵袭：将5×104个细胞接种在Transwell上部隔室的无血清培养基中，并在下部隔室中添加含10%FBS的DMEM培养基。24h后棉签擦拭基质胶和上部隔室的细胞，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，0.1%结晶紫染色30min。倒置显微镜观察。重复3次。1.11qRT-PCR检测：按试剂盒操作说明，加Trizol提取各组细胞总mRNA，mRNA质量检测完毕后，逆转录合成cDNA，cDNA为模板，特异性扩增VEGF、HIF-1α，GAPDH为内参。VEGF及HIF-1αmRNA表达量应采用2-△△Ct方法计算。各引物序列见表1。
2结果
2.1HIF-1α蛋白表达在不同siRNA下的影响：利用Westernblot筛选合适的HIF-1αsiRNA转染用于后续实验。由图1，在MDA-MB-231细胞中，相比Control组，2#、3#siRNA组的HIF-1α蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)，且3#siRNA抑制效果比2#siRNA更好，因此后续实验选择3#siRNA进行转染。图1不同siRNA对MDA-MB-231细胞中HIF-1α蛋白表达情况2.2MDA-MB-231/CDDP细胞活性在二至丸合桂枝汤联合用药下的影响：由图2，作用24h、48h后，与A组相比，C组和D组细胞活性均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。图2MDA-MB-231细胞活性变化情况（-x±s，n=6)2.3二至丸合桂枝汤联合用药对MDA-MB-231/CDDP细胞凋亡的影响：由图3，与A组相比，各组别细胞凋亡率均有一定程度的升高，其中，D组促进细胞凋亡效果最好，凋亡率最高。2.4二至丸合桂枝汤联合用药对MDA-MB-231/CDDP细胞侵袭能力的影响：由图4，各给药组不同程度地抑制细胞侵袭。与A组相比，细胞侵袭能力显著降低(P＜0.05，P＜0.01)的是C和D组MDA-MB-231/CDDP，且D组抑制细胞侵袭能力最显著。2.5MDA-MB-231/CDDP细胞中VEGF、HIF-1αmRNA及蛋白表达在二至丸合桂枝汤联合用药下的影响：由图5可知，与A组相比，VEGF、HIF-1αmRNA表达均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，在各干预组MDA-MB-231/CDDP细胞中，C组、D组细胞中HIF-1α、VEGF蛋白表达水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中，降低程度最明显的是D组细胞中HIF-1α、VEGFmRNA及蛋白表达。
讨论
TNBC在中医学属“奶岩”“乳岩”等范畴，病位在乳房，病根在肝肾，治疗的关键在于补肾益肝、调理阴阳。临床研究发现，二至丸合桂枝汤可通过上调5-羟色胺、抑制素B水平，有效改善绝经前Luminal型乳腺癌患者的临床症状[1]。研究表明，HIF-1αsiRNA通过Westernblot筛选而来，从结果得出，受到明显抑制的是位于3#siRNA组MDA-MB-231细胞中的HIF-1α蛋白表达，故选用3#siRNA组HIF-1αsiRNA进行转染。CCK-8检测结果作用24h、48h后，D组可显著抑制细胞活性且效果最好，提示二至丸合桂枝汤联合顺铂可有效抑制MDA-MB-231/CDDP细胞活性，有效改善MDA-MB-231/CD-DP细胞的耐药性。HIF-1可调节氧代谢，HIF-1α在多种肿瘤中表达高[2]。乳腺癌细胞耐药形成过程中HIF-1α意义特殊，利用HIF抑制剂共同给药可逆转耐药。此外，VEGF在多种肿瘤疾病中作用显著，可促进肿瘤血管新生和癌细胞增殖[3]。研究发现，VEGF受HIF-1α调控，可促进VEGF表达，提高肿瘤细胞适应缺氧微环境，进而利于癌细胞的生长浸润与迁移[4]。研究指出[5]，通过抑制HIF-1α/VEGF信号传导途径，可提高多西他赛的化学敏感性，抵抗转移性去势抵抗性前列腺癌的进程。各干预组均可在一定程度上降低MDA-MB-231/CDDP细胞中VEGF、HIF-1ɑmRNA及蛋白表达，且D组降低程度最显著，证实二至丸合桂枝可介导HIF-1α通路，下调VEGF表达，逆转顺铂耐药性，加大顺铂对TNBC的治疗效果。HIF-1α还可活化促凋亡分子，拮抗抑凋亡分子，参与细胞凋亡[6]。研究结果证实，介导HIF-1α途径抑制VEGF表达量，可促进卵巢癌细胞凋亡。各干预组均可上调MDA-MB-231/CDDP细胞凋亡率，而HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤+顺铂组凋亡率最高，证实二至丸合桂枝汤可增加MDA-MB-231/CDDP细胞对顺铂的敏感度，通过抑制HIF-1α表达，然后加快细胞凋亡。综上，二至丸合桂枝汤可通过抑制HIF-1α通路，下调VEGF表达，调控TNBC细胞系的顺铂耐药性。
作者：杨慧芬 毛娟娟 单位：杭州市中医院 宁波市中医院
