作者：符少莲，周光雄，黄美燕
【摘要】 目的建立菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣质类化合物的hplc含量测定方法，并对提取物hplc指纹图谱条件进行研究分析。方法采用反相c18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），甲醇－0.5%乙酸水溶液为流动相，梯度洗脱，柱温为25℃，流速为0.8 ml/min，在276 nm下进行检测。结果菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣质类化合物1,2,6-三没食子酰-β-d-葡萄糖的含量为85.7 mg/g，加样回收率为92.49%；1,2,4,6-四没食子酰-β-d-葡萄糖的含量为244 mg/g，加样回收率为96.41%；初步探讨了菱角皮提取物的指纹图谱条件。结论采用高效液相法测定菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣质类化合物的含量，简便、快速、准确；初步得到分离菱角皮提取物各特征峰的色谱条件，为以后建立指纹图谱和制定菱角皮药材及其活性提取物的质量标准提供了依据。
【关键词】 菱； 果皮； 鞣酸； 高效液相色谱； 指纹图谱
abstract：objective to establish determination method of tannin compounds from bioactive ethyl acetate extract of the fruit crust of trapa bispinosa roxb by hplc, and to study on analysis conditions of hplc fingerprint of the extract. methodsuse reverse phase c18 column（4.6 mm×200 mm，5 μm）, detection wave-length at 276 nm, column temperature at 25℃, flow rate at a 0.8 ml/min, and gradient aqueous methanol solution containing 0.5% acetic acid as a mobile sthe determination of tannic acid compound 1, 2, 6-tri-galloyl-β- d-glucose from the extract was 85.7mg/g, and the average recoveries was 92.49%; the determination of tannic acid compound 1, 2, 3, 6-tetra-galloyl-β-d -glucose was 244 mg/g, and the average recoveries was 96.41%; a preliminary study on conditions of hplc fingerprint for the bioactive extract was carried out. conclusionthe determination method for the tannin compounds from ethyl acetate extract of the fruit crust of the plant by hplc is simple, fast and accurate. chromatographic conditions of ethyl acetate extract of the plant was initially obtained, which provide the basis for establishment of the hplc fingerprint and making quality standard of the crude drug and its bioactive extract from the plant.
key words：trapa bispinosa roxb; fruit crust; tannin; hplc；fingerprint 菱trapa bispinosa roxb，一年生浮水或半挺草本，属菱科。我国有15种和11变种，产于全国各地，以长江流域亚热带地区分布与栽培最多［1］。其性甘味凉，无毒，入肠、胃二经，有清热祛暑、除湿祛风、益气健脾之功［2］。菱壳，为菱科植物菱或其同属植物的果皮。其作为药物始载于《本草纲目拾遗》。据《中华药海》所载，其性味微苦、涩，凉，入肺、脾、大肠三经，具有解毒疗疮、涩汤止泻、清化湿热的功效［2］。 经查阅文献得知，东北菱t. manshurica flerov菱角的提取物确实有一定的抗肿瘤活性［3～5］。在我们的前期工作中，选取菱trapa bispinosa roxb的菱角皮作为研究对象，采用mtt法对菱角皮提取物抗肝癌hepg2细胞活性成分进行活性追踪，采用液－液萃取提取物各极性部位，也证实了菱角皮醋酸乙酯提取物对hepg2细胞有一定的抑制作用；采用反相c18柱层析和sephadex lh-20排阻层析分离活性成分，得到两个鞣质类化合物1, 2, 6-三没食子酰-β-d-葡萄糖（1）和1, 2, 4, 6-四没食子酰-β-d-葡萄糖（2），对该两个化合物进行了抗癌活性实验，证实其对hepg2细胞有一定的抑制作用（待发表）。此前，有研究表明存在于东北菱菱角中的没食子酸具有诱导hela肿瘤细胞凋亡的作用［3］。两个化合物化学结构式见图1。
本研究将对菱角皮的醋酸乙酯活性部位中鞣质类化合物进行hplc定性定量方法研究，旨在建立hplc含量测定方法，并对菱角皮醋酸乙酯提取物hplc指纹图谱条件进行研究分析。
1 仪器与材料
1.1 仪器agilent technologies 1200 series高效液相色谱仪，电子天平（acculab sartorius group），旋转蒸发仪（eyela）。
1.2 药材菱壳为从湖南长沙购买的菱角（第1批）、江西采集的菱角（第2批）和购买的菱角（第3批）果实去肉后的硬壳，药材经暨南大学药学院生药学教研室鉴定为菱trapa bispinosa roxb的果壳。药材样品留存于暨南大学药学院生药学教研室。
1.3 标准品1, 2, 6-三没食子酰-β-d-葡萄糖（1）、 1, 2, 4, 6-四没食子酰-β-d-葡萄糖（2）和没食子酸（3）对照品为本实验室提纯物,其中（1）和（2）为从该实验提取物中分离得到，并经光谱法鉴定结构。甲醇为色谱纯，江苏汉邦科技有限公司产品；其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 hplc定量分析
2.1.1 色谱条件色谱柱为依利特c18柱（4.6 mm×200 mm，5 mm）；检测波长：276 nm；柱温：25℃；流动相：a 甲醇，b 0.5％乙酸水溶液；梯度洗脱条件：0～10 min，10%a～20%a；10～30 min，20%a～40%a；30～32 min，40%a～100%a；32～42 min，100%a；42～47 min, 10%a；流速：0.8 ml/min。 在上述色谱条件下，化合物1 峰的保留时间在20.55min左右，化合物2峰的保留时间在25.31min左右，化合物3保留时间在6.10min左右,并且分离度良好。对照品、供试品高效液相色谱图见图2。
2.1.2 对照品溶液的制备精密称取化合物10.002 3 g，置5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。配制成0.46 mg/ml的化合物1标准液。
精密称取0.004 1 g，化合物2置5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。配制成0.82 mg/ml的化合物2标准液。 精密称取化合物30.002 1 g，置5 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。配制成0.46 mg/ml的化合物3标准液。
2.1.3 供试品制备取菱角皮，粉碎成细粉，取粉末100 g，用5倍量85%乙醇冷浸两次，第1次为72 h，第2次为48 h，过滤前超声两个小时，过滤，合并冷浸液，滤液低温（<60℃）减压回收乙醇，浓缩得菱角壳提取物。将此提取物用适量水（100 ml）混悬，再依次用石油醚（50 ml）、氯仿（50 ml）、醋酸乙酯（50 ml）萃取水混悬液各3次，减压下蒸干溶剂，得醋酸乙酯提取物。
2.1.4 标准曲线的制备分别取化合物化合物1，化合物2和对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，以甲醇定容至10 ml容量瓶中，制得不同浓度对照品溶液。精密吸取20 ml注入高效液相色谱仪，以对照品浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，线性回归得化合物1方程：y=58 399x-147.85，r=0.999 6；化合物2方程：y=52 715x-241.24，r=0.999 8。
结果表明化合物1在0.009 2～0.046 mg/ml，化合物2在0,0164～0.082 mg/ml范围内线性关系良好。
2.1.5 精密度实验取化合物1对照品溶液，精密吸取20 ml进样，重复进样5次，测得化合物2峰面积平均值为1 980.7，rsd为1.52%。
2.1.6 稳定性实验分别于0，1，2，4，8，12 h对同一供试品溶液进样测定，进样量为20 ml，结果化合物1平均峰面积为1351.86，rsd为1.79%，化合物2平均峰面积为3 622.48，rsd为1.24%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.1.7 重复性实验精密称定菱角皮醋酸乙酯提取物5份各0.003 0 g于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。精密吸取20 ml进样测定。结果见表1～2。表1 化合物1峰重复性实验结果（略）表2 化合物2峰重复性实验结果（略）
2.1.8 加样回收率实验
化合物1加样回收率实验:精密称取化合物1 0.002 6 g于25 ml容量瓶，并精密称取0.002 1 g菱角皮醋酸乙酯提取物于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度；再分别吸取该化合物1溶液1 ml和菱角皮醋酸乙酯提取物溶液5 ml于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度；吸取20 ml进样测定，按该法平行测量3次。结果见表3。表3 化合物1加样回收率实验结果（略） 化合物2加样回收率实验：结果见表4。表4 化合物2加样回收率试验结果（略）
2.1.9 样品含量测定精密称取0.003 0 g菱角皮醋酸乙酯提取物于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。精密吸取20 ml进样，重复进样5次，测得化合物1峰面积平均值为1 354.28，rsd为1.52%，化合物1含量为85.7 mg/g；化合物2峰面积平均值为3 622.48，rsd为1.24%,化合物2含量为244 mg/g。
2.2 指纹图谱研究
2.2.1 色谱条件色谱柱为依利特c18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；检测波长：276 nm；柱温：25℃；流动相：a甲醇，b 0.5%乙酸水溶液；梯度洗脱条件：0～15 min，10%a～20%a；15～30 min，20%a～50%a；30～60 min，50%a～100%a；60～65 min，100%a；65～75 min,10%a；流速：0.8 ml/min。
2.2.2 方法学验证
重复性实验:精密称定“2.1.3”项下制备的菱角皮醋酸乙酯提取物0.002 0 g各5份于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。精密吸取20 ml进样，各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积rsd小于1.5%。
稳定性实验：已在“2.1.6”项下证明了菱角皮醋酸乙酯提取物溶液在12 h内稳定。
精密度实验：已在“2.1.5”项下证明了该环境下测量精密度良好。 指纹图谱：选取不同产地药材两角菱皮和四角菱皮按“2.1.3”项下要求制备醋酸乙酯提取物，并分别精密称定0.002 0 g于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，精密吸取20 ml进样，所得谱图与“2.3”项下制备的菱角皮醋酸乙酯提取物进行对比。结果见图3～6。
由图3～5可得，3个药材都在5.645，22.803，24.314，25.66，45.66，48.391，52.406 min左右出现特征色谱峰。 分别吸取化合物1，2，3对照品溶液于该色谱条件下进样，可知5.645 min色谱峰为没食子酸，22.803 min色谱峰为化合物1，25.66 min色谱峰为化合物2。
3 讨论
本研究对菱角皮抗肿瘤活性部位两个鞣酸类主要成分1，2, 6-三没食子酰-b-d-葡萄糖和1, 2, 4, 6-四没食子酰-b-d-葡萄糖首次进行了定量分析方法研究并进行了样品hplc定量分析，首次初步分析了菱角皮醋酸乙酯提取物活性部位的hplc指纹图谱。结果表明采用高效液相法可测定菱角皮醋酸乙酯提取物中两个鞣酸类化合物的含量，具有简便、快速、准确特点，所建立的hplc提取物指纹图谱分析方法可用于该活性部位质量控制。
选用文献报道的流动相甲醇-0.5%乙酸水溶液进行分离，化合物1、2峰形良好，但是大量极性相对较低的杂质吸附在色谱柱上无法洗脱, 严重影响后续的含量测定。所以, 本实验采取固相萃取（spe）和梯度洗脱步骤, 去除这一些杂质干扰,保证了后续hplc指纹图谱和定量分析顺利进行。 初步得到分离菱角皮提取物各特征峰的色谱条件，也为以后进一步完善建立提取物指纹图谱分析方法和制定菱角皮药材的质量标准提供了依据。
【参考文献】 ［1］吴征镒.中国植物志，53卷二分册［m］.北京：科学出版社,2000:1. ［2］冉先德.中华药海［m］.哈尔滨：哈尔滨出版社，1993：1584. ［3］牛凤兰，伊健元，董威严．菱角中抗肿瘤活性成分的分离、提纯及结构鉴定［j］.高等学校化学学报，2005，26(5)：852. ［4］牛凤兰，李晨旭，董威严.东北菱提取物对肝癌细胞的体内外抑制作用［j］.吉林大学学报（医学版），2002，30(4)：553. ［5］牛凤兰，张秋月.菱壳水提物对胃癌细胞抑制作用的实验研究［j］.白求恩医科大学学报，2001，27(5)：495.
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