体外抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因检测方法(体外抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的药物)

【摘要】 目的: 筛选能高效抑制乳腺癌细胞株mcf7和mdamb453端粒逆转录酶（htert）基因表达的rna干扰靶点，为乳腺癌的基因治疗提供依据. 方法: 构建针对htert基因的三种sirna(sirnahtert1, sirnahtert2和sirnahtert3)，分别转导入乳腺癌细胞株mcf7和mdamb453，同时以无同源性的sirnahtert4作阴性对照，含gfp基因的载体作阳性对照. 应用实时聚合酶链反应（realtime pcr）和western blot技术检测sirna处理前后htert基因表达变化；mtt法检测细胞生长率；流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响. 结果: 与阴性对照组相比，sirnahtert1，sirnahtert2和sirnahtert3三个实验组sirna转染细胞后，htert的mrna表达量下调至21%~40%，蛋白表达下降至50%，而三个实验组间差异无统计学意义（p>0.05）. 转染48 h 后，mcf7细胞抑制率分别为(57±4.3)%，（61±4.3）%，（65±6.0）%；mdamb453细胞抑制率分别为（45±5.1）%，（45±4.1）%，（50±4.0）%. 流式细胞仪检测结果显示，细胞凋亡率有所增加，mcf7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；mdamb453细胞为(12.25±0.17)%，（17.80±0.19）%，（20.60±0.21）%. 结论： 经sirnahtert1，sirnahtert2，sirnahtert3处理均可明显抑制mcf7和mdamb453乳腺癌细胞的增殖及htert基因的表达，能够明显促进细胞的凋亡.

【关键词】 乳腺肿瘤；端粒酶逆转录酶；rna干扰

0引言

端粒逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，htert）是端粒酶组成的亚单位，与肿瘤的发生、发展密切相关［1-2］. 新近的研究［3-4］表明，应用小片段干扰rna（sirna）沉默或下调htert表达，可降低端粒酶的活性，缩短端粒，从而使肿瘤细胞的生长受到抑制［5-6］. 不同sirna转染效率的不同以及靶向htert的不同，sirna对端粒酶活性抑制的程度也有所不同［7］. 本研究拟通过设计多对靶向htert基因的sirna，转导入不同的乳腺癌细胞株，筛选出具有特异性下调htert基因表达的sirna，旨在为乳腺癌的基因治疗提供依据.

1材料和方法

1.1材料乳腺癌mcf7和mdamb453细胞株(上海细胞生物研究所)；lipofectaminetm2000转染试剂，总rna提取试剂trizol，realtime pcr试剂盒（大连takara公司）；兔抗htert多克隆抗体，辣根酶标记羊抗兔igg（美国sigma公司）；co2孵育箱（hepa class 100, 德国thermo公司）；实时荧光定量(realtime) pcr仪（light cycle，美国roche公司）；流式细胞仪（epics xl，美国coulter beckma公司）；蛋白电泳和电转仪（ve186，中国上海天能科技有限公司）.

1.2方法

1.2.1sirna设计根据htert基因的dna序列（genbank accession _198255.1）设计出互补的3对（sirnahtert1，sirnahtert2和sirnahtert3）sirna序列［8］，sirnahtert4为无同源性的阴性对照序列. sirna片段由广州锐博生物科技有限公司合成，其序列为：sirnahtert1正义链：5′ggagcagcugcggcccuccdtdt3′,反义链：5′dtdtccucgucgacgccgggagg3′；sirnahtert2正义链：5′aagagggccgagcgucucadtdt3′,反义链：5′dtdtuucucc cggcucgcagagu3′； sirnahtert3正义链：5′ugauuucuuguuggugacadtdt3′,反义链：5′dtdtacuaaagaacaaccacugu3′；sirnahtert4正义链：5′ggcctagctgcgcgagu3′,反义链：5′ggcctcagctgcgcgacga3′.

1.2.2sirna转染转染前1 d，换取新鲜培养液后调整密度为2×108个/l，待细胞生长至60%～80%融合时，将sirna脂质体混合物（100 μg/5 l）转染至细胞中，在37℃，50 ml/l co2无血清、无抗素培养液培养16～18 h，换新鲜100 ml/l胎牛血清培养基，继续培养2～5 d后检测各指标. 实验分为空白对照组（不含转染试剂和sirna）；阴性对照组（sirnahtert4处理）；阳性对照组（含gfp基因的载体处理）和三个实验组（sirnahtert1，sirnahtert2和sirnahtert3处理）.

1.2.3sirnahtert转染乳腺癌细胞株后htert表达变化的检测

1.2.3.1实时聚合酶链反应（realtime pcr）分别收集各组转染后48 h的细胞，提取细胞总rna，逆转录成cdna. 取rt产物作为模板，进行realtime pcr，检测htert引物为：正义5′ccgtctgcgtgaggagatc3′, 反义5′tccggtagaaaaagagcctgtt3′；htert taqman探针：5′（fam）ggccaagttcctgcactggctgact（tamara）3′；gapdh引物：正义5′ccaggtggtctcctctgactt3′，反义5′gttgctgtagccaaattcgttgt3′；gapdh taqman探针：5′（fam）aacagcgacacccactcctccacc（eclipse）3′. realtime pcr反应体系为20 μl，包括：2×premix ex tagtm缓冲液10 μl,10 μmol/l上下游引物各0.4 μl,探针0.8 μl, cdna 2 μl,加双蒸水补足至20 μl. 反应条件：95℃ 10 s预变性后，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40个循环，每个样本设三个平行反应. gapdh作为内参对照校正上样量. 以2(δδct) 方法计算htert mrna的相对表达量.

1.2.3.2免疫印迹（western blot）检测分别收集转染48 h后的各组细胞，用预冷的pbs进行洗涤，加入蛋白裂解液进行裂解，提取总蛋白. 分别取50 μg蛋白，变性后经100 ml/l sdspage分离，将凝胶置转移缓冲液中平衡15 min，再80 v 1.5 h湿转印蛋白到pvdf上， 100 ml/l fbs/tbst 4℃封闭过夜，加一抗，37℃震荡温育1 h, tbst漂洗3次，每次15 min，加hrp标记二抗，37℃震荡温育1 h, tbst漂洗3次，每次15 min. 取等量的ecl发光试剂a，b液混匀后孵育硝酸纤维素膜，压曝光，以βactin为内参.

1.2.4mtt法检测取对数生长期细胞，经2.5 g/l胰蛋白酶消化，用含100 ml/l新生牛血清的dmem培养液配成单个细胞悬液，以每孔3×103个细胞接种96孔培养板中，加入培养液200 μl，37℃，50 ml/l co2培养箱培养. 次日进行瞬时转染，分别在转染后24,48,72,96 h进行检测. 检测时每孔中加入5 g/l mtt 20 μl，继续培养4 h，到达检测点时弃去培养液，再加入dmso 200 μl，震荡10 min，于自动酶标仪492 nm波长处测定各孔吸光度（a）值. 按照公式计算细胞生长抑制率. 抑制率(%)=［(对照组a492 nm-实验组a492 nm) /对照组a492 nm］×100%.

1.2.5细胞调亡的流式细胞术检测收集转染后48 h各组细胞，预冷pbs洗涤2次，用预冷的1×结合缓冲液重悬细胞，调整终密度为5×109个/l，将试管置于冰上，加5 μl的annexin vfitc溶液和2.5 μl的碘化丙啶（propidium iodide, pi ）至100 μl的细胞悬液中，避光孵育10 min后，加入400 μl冰预冷的1×结合缓冲液，30 min内用流式细胞仪进行检测，分析各组细胞的凋亡情况.

统计学处理：采用spss11.0统计分析软件，细胞增殖实验中各处理组与对照组进行配对t检验，各实验组间进行f检验. p<0.05为差异具有统计学意义.

2结果

2.1sirna转染后绿荧光蛋白的表达倒置显微镜明视野下，阴性对照组和阳性对照组细胞生长正常，形态无明显变化；倒置荧光显微镜暗视野下，阳性对照组的部分细胞胞内呈现绿色（图1）.

a,c: 转染含gfp基因的载体后mcf7和mdamb453细胞表达绿荧光蛋白; b,d: 明视野下mcf7和mdamb453细胞的生长形态.

图1倒置荧光显微镜下mcf7和mdamb453细胞的绿荧光蛋白表达×400

2.2转染后细胞htert表达的变化以阴性对照组原始模板的相对浓度为标准，经 sirnahtert1，2和3转染后，htert mrna的相对表达量，mcf7细胞分别为：35%，30%，31%；mdamb453细胞分别为36%，33%，21%，sirnahtert1，2和3三个实验组间进行h检验，组间差异无统计学意义（p=0.368，p>0.05）. western blot检测结果显示，sirnahtert1，2和3三个实验组蛋白表达明显降低(p=0.00)，与阴性对照组相比较，三组间差异无统计学意义（p=0.223，p>0.05，图2）. 经sirnahtert1，2，3和4处理后，htert蛋白条带灰度mcf7细胞分别为35%，25%，24%，76%；mdamb453细胞分别29%，23%，29%，70%.

2.3转染后细胞增殖的变化48 h后sirnahtert1，2和3三个实验组和阴性对照组对mcf7细胞的抑制率分别为(57±4.3)%,（61±4.3）%,（65±6.0）%,（5.3±3.5）%；对mdamb453细胞的抑制率分别为（45±5.1）%,（45±4.1）%,（50±4.0）%,(6.7±3.6)%. 配对t检验分析果显示，sirnahtert1，2和3三个实验组对mcf7细胞的生长抑制明显高于阴性对照组（p=0.023，0.016，0.028）；对mdamb453细胞的生长抑制也明显高于阴性对照组（p=0.024，0.018，0.027），但三个实验组间的变化不明显（p=0.075, 0.085）.

2.4基因沉默对细胞凋亡的影响sirnahtert1，2和3转染mcf7和mdamb453细胞48 h后，流式双标记检测结果显示，与阴性对照组相比较，annexin 单染和annexinv/pi双染阳性细胞明显增加（f=124，p=0.00，图3）. 其中，sirnahtert1，2和3三个实验组annexin 单染的细胞凋亡率mcf7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；mdamb453细胞为(12.25±0.17)%,（17.80±0.19）%,（20.60±0.21）%.

3讨论

目前用针对疾病相关基因的sirna进行基因治疗已取得了一定的进展，已有几种rna技术新药进入临床实验，但尚未应用于肿瘤治疗. 有研究［9］发现htert基因在乳腺癌发生发展中起重要作用，目前有关抑制htert表达的研究多采用一种sirna作用于某一种肿瘤细胞. 本实验设计三种靶向乳腺癌细胞株htert基因的sirna，研究目的基因下调对细

a,b: mcf7细胞的阴性对照组和sirnahtert1组; c,d: mdamb453细胞的阴性对照组和sirnahtert1组. sirnahtert2和3组与sirnahtert1组相似. 图中左上象限: annexinv/pi双染区; 右下象限为annexin单染区. pi: 碘化丙啶; annexin v: 磷脂结合蛋白v.

胞生长的影响，结果显示，三种sirna都可下调htert基因表达，使mcf7和mdamb453两种乳腺癌细胞株的生长受到抑制. 但不同的sirna对同一基因的沉默效果存在差异，因此，在靶向基因htert的sirna选择和设计时，我们选择htert基因外显子不同区域、不同碱基含量的3对长度为19 bp的sirna片段，探讨不同靶点rna干扰效果的差异，转染结果表明，sirnahtert1，2和3三个实验组和对照组htert基因表达几乎无变化，sirnahtert1，2和3三种sirnahtert处理后htert的mrna和蛋白表达均明显下调. 同时，采用sirna转染来源不同的乳腺癌细胞株后，无论是mcf7还是mdamb453细胞株，经sirnahtert1，2和3三种sirna处理后，细胞增殖均受抑制，48 h后出现不同程度的调亡，这提示sirnahtert1，2和3三种sirna可较好的作用于不同来源的乳腺癌细胞，为rna干扰药物应用于乳腺癌治疗奠定了基础.

综上所述，本研究利用rnai技术筛选出3对sirna，均可特异性下调乳腺癌细胞株htert基因的表达；导入mcf7和mdamb453两种乳腺癌细胞株后，可明显抑制肿瘤细胞的增殖，使部分细胞发生调亡，这为乳腺癌基因治疗的临床研究提供了依据.

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