受精的时间为(胚囊自受精日起超过多少天就不能用于研究)

中国论文网 发表于2022-11-05 11:54:05 归属于医疗卫生 本文已影响152 我要投稿 手机版

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 在常规体外受精- 胚胎移植(IVF-ET)中,现在大多中心将授精时间安排在hCG注射后42 h内进行,精卵共孵育后16~18 h后去除卵丘细胞进行原核的观察。本中心在2011年11月前授精时间均安排在hCG注射后43~44 h左右,2012年开始改为hCG注射后39~40 h。为了探明IVF-ET中hCG注射后授精时间延迟是否影响胚胎质量,笔者分析了本中心推迟授精3~4 h前后两个时段授精后的相关临床资料,希望能为临床提供相关的基础数据。
  1 资料与方法
  1.1 一般资料 选择2010年1月-2013年4月在本中心行常规体外受精- 胚胎移植(IVF-ET)的患者。纳入标准:年龄≤35岁,长方案。
  1.2 方法
  1.2.1 获取卵母细胞 采用黄体中期长方案降调节。前1个月经周期第3天开始妈富隆口服1片/d,17 d后或自然周期B超监测排卵后7 d开始给药短效达菲林1.0 mg/d或0.05 mg/d皮下注射垂体降调节至hCG日。促排卵采用果纳芬(GonalF,瑞士Serono公司),根据B超监测卵泡大小和血清雌二醇(E2)水平适当调整药物剂量,当大卵泡数量占14 mm卵泡30%以上停用促性腺激素,当晚8点肌肉注射hCG(丽珠公司)10 000 IU,36~38 h后在B超引导下取卵。从卵泡液中挑出卵冠丘复合物(OCCC),移入含10%血清代用品(SPS)(IRVINE,USA)的人输卵管液(HTF)(IRVINE,USA)培养液,37 ℃、5% CO2培养箱培养,6 h后行常规体外受精(2012年以后4 h后行常规体外授精)。
  1.2.2 精子准备 患者丈夫禁欲3~7 d,取卵当天上午9点左右手淫法取精,精液置室温下30 min,液化后采用密度梯度离心方法处理:用精子分离液(美国SAGE IVF,Inc.公司)80% PureCeptionTM 1.5 ml放在15 ml离心管底部,上层缓缓加入1.5 ml 40% PureCeptionTM分离液,最后加1.5~2.0 ml液化好的精液,300 g离心10 min,取精子沉淀,加入Quinn’s HTF 受精培养液2 ml洗涤,200 g离心5 min;取精子沉淀滴入孵育后的Quinn’s HTF受精培养液0.5 ml中,调整精子浓度为20~40×106/ml,放入6 ml圆底试管内,置于5%、CO2、37 ℃培养箱内培养,使精子获能。
  1.2.3 常规体外受精与胚胎培养 取卵后42~43 h(2012年以后39~40 h),按常规体外受精方法加入优选后的精子,置37 ℃、5%、CO2培养箱;于授精后16~18 h后拆除颗粒细胞,观察受精情况。然后移入含10% SPS(IRVINE,USA)的1026(IRVINE,USA)培养液中;每日上午8:00左右观察。将为2011年前为A组,2012年后为B组,统计并比较两组的受精率、卵裂率、优质胚胎率及可利用胚胎率。
  1.3 胚胎质量评估 正常受精的标准是见到两个清晰的原核。在受精后第3天,观察卵裂球的形态,并且根据卵裂球形态与大小、有无多核、碎片多少、分布及胞浆情况等进行胚胎评分,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胚胎,第三天卵裂球数≥7,碎片≤15%,无不均及多核为优质胚胎。
  1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析,计数资料采用 字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  对5493枚卵子进行观察可得,A组hCG注射后授精时间间隔大于42 h授精2105枚卵子,B组hCG注射后授精时间间隔小于40 h授精3388枚卵子,两组的受精率、卵裂率、优胚率、可利用胚胎率比较差异无统计学意义(P>0.05),虽然B组的可利用胚胎率有增高的趋势,但差异无统计学意义,见表1。
  3 讨论
  通常在IVF/ICSI治疗周期中,用外源性Gn对患者进行控制性促排卵,使在1个排卵周中使多个卵泡发育,通过获得比较多的卵子来提高每一个周期的妊娠率。在促排卵过程中,一般使用外源性hCG来模拟LH峰促使卵母细胞最后成熟、从而达到诱导排卵的目的。但是也有报道显示延长注射hCG后的取卵时间可以提高卵子的质量。本研究显示推迟授精时间同样没有影响到卵母细胞的受精率、卵裂率、优质胚胎率和可利用胚胎率。
  卵子的受精是体外受精过程中的关键步骤,是成熟的精子与次级卵母细胞相互作用并结合成为受精卵的过程。在正常人体中,精子与卵子的相互作用以及卵子受精是在性交后20 min内,当一个正常精子到达卵子表面,精子的顶体外膜会发生破裂,释放出顶体酶,可以溶解卵子外周的放射冠,继而和透明带发生顶体反应,这样精子头部就可以穿过放射冠和透明带与卵子的胞质接触,只要有一个精子进入卵母细胞,就可以立即阻断Ca2+流动,并发生皮质反应、透明带反应、卵黄膜反应,使其他精子不能进入,上述过程瞬间即可完成[4]。罗光彬等[4]对家兔进行超促排卵后,在注射HCG后14、16、18 h不同的时间段取卵,然后进行ICSI,观察兔胚胎在体外发育的情况,发现ICSI后的受精率分别为82.2%、75.9%和0[5]。桑椹胚形成率分别为92.9%、70.0%、0,囊胚形成率分别为62.2%、53.3%、0。精子核的去浓缩以及原核形成是胚胎发育所必需的过程,雄原核形成失败与卵母细胞中谷胱甘肽活性低有关。该研究提示卵子成熟后随着卵龄增加谷胱甘肽含量被消耗,可能损害到雄原核的发育,造成受精率降低,注射成熟度偏老的卵子可能会增加损伤纺锤体的机会,损伤到纺锤体的胚胎发育潜能会降低。因此过度延长hCG后的取卵时间可能会影响到获卵率、卵子质量以及形成胚胎后的质量。也有研究显示在体外受精周期中[6],未成熟的卵子在体外培养成熟后,卵子受精率降低。MⅠ或者GV期的卵子在体外培养4~6 h后并不能使细胞核与胞质的同步化成熟,只有核与胞质同时成熟的卵子才能有好的受精率、卵裂率和胚胎可用率等[7]。eIF4E、EGF类生长因子、PACAP、NuMA等蛋白或因子在卵母细胞的成熟、受精及胚胎发育中都有重要作用[8-11]。本研究显示推迟授精时间并没有影响到卵母细胞成熟、受精率和可利用胚胎率。但资料显示授精时间延后妊娠率却有下降的趋势,因此只有对于取卵时卵子成熟度偏生的完全可以推迟授精,获得更多的可利用胚胎[12]。使患者对自己获得妊娠有更好的预期,使患者的依从性更好。对于成熟度较好的卵母细胞还是推荐在hCG注射后39~40 h进行,以便保证良好的妊娠率。优胚率和可利用胚胎率没有差异可能是因为在延长培养时间后,虽然将一部分成熟度比较差的卵母细胞胚胎成熟,但致使原来成熟度比较好的卵母细胞老化,对于这部分卵母细胞反而不利,因此并不能将所有情况全部推迟授精,只在获得卵母细胞时对于成熟度大部分都偏生的情况下,延长培养时间,推迟授精。
  现在普遍认为授精时间是在hCG注射后39~40 h,此时段授精的临床妊娠率是最优的。但是有10%~15%情况仍会出现授精失败及低受精率的情况,现在通常在受精后6 h左右提早拆除卵子周围颗粒细胞,通过观察卵子第二极体的排出情况判断是否受精,如果有不受精或低受精的情况可立即行补救ICSI。因此取卵后授精的时间应该根据卵子的成熟度,适当的提前或延迟授精,在卵子的最佳情况下授精,同时在不影响胚胎质量的前提下早期观察受精情况,最大限度地避免受精失败的发生,从而减轻患者的经济及精神负担。
  本研究没有将临床妊娠率做对比,因为后期临床方案和移植原则、冷冻原则改动,对妊娠率的影响也比较大,所以只比较了实验室数据,这样可以更客观的说明授精时间对胚胎质量的影响。
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