【摘要】 目的：以琼脂糖水凝胶为材料，制备一种神经组织工程支架。 方法：琼脂糖水凝胶溶于双蒸水中，利用自制的模具制备支架，冷冻干燥。经显微镜下观察测量其孔隙大小等指标。测试0.01mol·l-1磷酸盐缓冲液(pbs)中10天的体外降解率，并埋入sd大鼠皮下看其与周围组织反应。结果：制备出的支架具有半透性外壳及高孔隙率的内部海绵状结构，其微孔直径为40～125μm，体外降解率为5.17％，与周围组织基本无毒性反应。结论：琼脂糖水凝胶作为神经组织支架材料，具有一定的应用潜力。
【关键词】 琼脂糖水凝胶； 神经支架
脊髓损伤(spinal cord injury，sci)是临床上有严重危害的急性病损。每年因车祸(占41%)、暴力(22%)、跌落 (21%意义)、运动(8%)和其它(8%)等引起的脊髓损伤人数有增无减,其中82%是16-30岁的男性。脊髓损伤表现为“三高一低”的特点：(为3.0/10万-3.5/10万 ,国内主要大城市近几年的不完全统计也呈现增高趋势)、致残率高(全瘫患者占脊髓损伤患者 662.67%)、耗费高(由是于患者多是年轻人，而且其寿命与正常几乎一样长，所以,其治疗康复费用非常巨大。脊髓损伤所致截瘫，不仅给患者带来巨大的身心痛苦，而且也给家庭和社会带来沉重的经济负担和复杂的社会问题。因此，脊髓损伤的救治引起世界各国政府的广泛关注。
近年来，由于材料学和医学的结合日趋紧密，使得组织工程的进展飞速发展。经过大量实验，人们意识到目前关键是制作理想的神经组织工程支架材料。从目前众多组织工程支架的研究情况来看，我们选择琼脂糖水凝胶作为组织工程支架材料，利用自制的组织工程神经模具，通过冷冻干燥技术来制备一种有良好应用前景的神经组织工程支架材料。
1 材料与方法
1.1 琼脂糖水凝胶的制备
取琼脂糖粉末3 g溶于100 ml双蒸水中，磁力加热搅拌30分钟，温度控制在60 ℃以下，后待温度下降，加入1 g致孔剂，搅拌后放入自制神经模具中，冷冻干燥过夜于-4℃低温冰箱中保存。
1．2 支架材料内部光镜观察
将上述方法制备的支架材料置显微镜下，观察其横截面、纵截面及材料外表面，并测量材料微孔的直径。
1.3 体外降解率的测定
在每段支架上裁剪出长度为3 mm样品，电子天平称五次取平均值wm (精确到小数点后4位)。一个试管中放一段样品，加入15 ml0.01m pbs，恒温振荡器振动(v=50 rpm、t=37 ℃)。每隔两天换液一次，换液时离心，去上清，加入15 ml新的pbs。10天后收集剩余材料段，冻干，电子天平称重五次取平均值wt。(精确到小数点后4位)。将wm及wt代入下列公式计算降解率：
降解率(％)= wt/wm×100％
1.4 生物相容性实验：随机选4根支架裁剪出长度3 mm样品。sd大鼠称体重后用适量普鲁卡因腹腔注射麻醉，背部皮肤备皮后，消毒，铺巾、切开皮肤、潜行分离皮下、将样品埋入、缝合、标记。术后每周随机选一只sd大鼠，观察其周围组织学反应。
2 结果
2．1 材料的大体观察：通过冷冻干燥技术制备的神经组织工程支架均为规则的圆柱体，且外型均匀。表面光滑平整，连续性好。材料柔韧性较好，质地均匀，弹性尚可。
2.2 内部结构观察：支架外壳分为表面的致密层和深面的多孔层，呈半通透性。材料在光学显微镜下观察，其外表面为半封闭结构，密布细小的孔隙，中心部分孔径稍大为45～105μm。
2.3 体外降解率：将原始数据代入计算降解率的公式可得： 0.01mol·l-1磷酸盐缓冲液(pbs)中10天降解率为5.17％。
2.4 实验动物皮下埋植观察：各动物术后大约3h开始活动，之后饮食活动逐渐正常，毛发顺亮，切口愈合，周围无出血；材料周围组织未见坏死等现象。
3 讨论
目前脊髓损伤修复研究的主要方向是利用组织工程和神经干细胞相结合修复损伤脊髓。方法是将一定量的细胞种植到具有一定结构的三维支架上，然后将此细胞支架复合物植入体内或体外继续培养，通过细胞间的相互粘附、增殖和分化，从而形成具有一定结构和功能的组织或器官，达到修复损伤脊髓的目的。因此，应用组织工程移植神经干细胞是最具有前途的治疗脊髓损伤的方法，在脊髓损伤修复组织工程研究中，寻找合适的细胞支架是研究的核心。
近年来,由于组织工程化软骨、骨、皮肤、肌膜及部分内脏组织的研究取得明显的进展，促使神经组织工程研究有了新的进步。国内学者刘世清等[1]用同种异体羊膜材料复合神经生长因子替代神经材料桥接周围神经缺损结果发现其可以有效促进神经再生和功能恢复。程映华等[2]将壳聚糖制成外径3.0 mm，内径1.5 mm中空海绵柱状体，内加入神经干细胞复合材料，移植入大鼠骨髓t8缺损区域，可见由神经干细胞分化而来的神经元或神经胶质细胞，成簇状或散在分布于复合材料中，并见再生的神经纤维。flynn等[3]人将聚2羟乙基甲基丙稀酸脂水凝胶应用于神经组织工程的支架中，在脊髓损伤后，这种细胞外基质材料有潜能提高神经再生。为了更好的提供生物相容性，他们又将聚已酸内酯纤维用特殊方法嵌入聚2羟已基甲基丙稀酸酯凝胶体中，实验表明，随着聚已酸内酯纤维的进入，这种凝胶体能更好地充当桥梁的作用，支持轴突的再生和细胞的浸润，明显好过没有这种纤维的凝胶体。然而，这些材料就实际应而言又都存在不足之处，其一是支架与细胞之间没有良好的生物相容性，易引发免疫反应和变态反应，无法营造一个适合神经纤维生长的微环境；其二是支架内神经纤维的生长处于一种交互混乱的状态，使神经纤维无法沿着功能修复的方向生长；其三是没有良好的生物降解性，有的支架在功能还没重建完全时就已降解，降解率应没有与组织细胞生长率相适应。
上述问题的存在使我们认识到了怎么样才能更好的解决神经干细胞移植中的组织工程材料问题。从目前众多组织工程支架的研究情况来看，我们选择琼脂糖水凝胶材料，其优越性在于：1、当将固体的琼脂糖水凝胶支架植入脊髓损伤腔内时，它不会引起细胞的免疫反应，并且到少在一个月以内杯会降解，在这期间琼脂糖水凝胶支架会使细胞有效的再生[4]；2、通过已有实验观察得知，神经细胞与神经轴突的生长不会穿透琼脂糖水凝胶支架，琼脂糖水凝胶支架能够有效的引导轴突没着一定的方向再生[5]；3、冷冻干燥处理后的琼脂糖水凝胶支架柔软性能好，能适应脊髓所要求的支架的物理特性[6]。
本实验以琼脂糖利用自制的组织工程周围神经模具通过冷冻干燥技术制备的神经组织工程支架材料外部光滑，连续性好，质地均匀，弹性尚可。表面呈半封闭结构密布细小的孔隙，孔径多为50μm左右，有利于损伤局部微环境的物质交换，在富集有利于神经再生的各类物质(如神经生长因子等)的同时防止不利于神经再生纤维的物质(如硫酸软骨素等)在局部浓集。最大程度的提供了细胞生长和吸附、释放各种生长因子的空间。0.01 mol/l磷酸盐缓冲液(pbs)中10天降解率为5.17％，可随着神经的修复逐步吸收，避免了神经的卡压。动物术后饮食活动正常，毛发顺亮；切口愈合，周围无出血、感染；材料周围组织未见坏死等现象，组织学上看正常的材料植入后的无菌性炎症会逐步消失，基本无毒性反应。为神经再生纤维的生长提供良好的环境和条件。
综上所述，我们认为在神经缺损修复方面以利用自制的神经模具通过冷冻干燥技术制备的神经组织工程支架很有发展潜力。
【参考文献】
1 刘世清，李皓桓，杨溢秦，等.异体羊膜复合神经生长因子桥接长段周围神经缺损的可行性研究[j].中国临床康复, 2003，7（20）：2794-2796.
2 程映华，梁晶，王晓东，张沛云.壳聚糖nsc复合物修复大鼠完全性脊髓损伤的组织学观察[j]。中华实验外科杂志。 2004，1（21）：345-452.
3 flynn l, dalton pd, shoichet templating of poly (2hydroxyethyl methacrylate) for neural tissue engineering[j].biomaterials.2003，24(23): 4265-4272.
4 s. stokols, m.h. tuszynski. the fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury[j]. biomaterials，2004，25 (27)：5839-5846.
5 rajnicek s. britland c. mccaig. contact guidance of cns neurites on grooved quartz: influence of groove dimensions, neuronal age and cell type[j].j cell sci，1997，110 (part 23)：2905-2913.
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