【摘要】 目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, ra)是一个多基因多因素参与的病理过程。实验中通过建立与ra发病机制相似的胶原诱导性关节炎(collageninduced arthritis,cia)大鼠动物模型,运用蛋白质组技术对正常大鼠和cia大鼠模型不同时间点滑膜组织的蛋白质点进行比较分析,为鉴定cia大鼠滑膜病变相关蛋白质及研究ra发病机制奠定基础。方法:用牛ⅱ型胶原和完全福氏佐剂建立cia大鼠模型,采用一步抽提法抽提滑膜蛋白质,运用固相ph梯度双向凝胶电泳分离各组大鼠滑膜组织的总蛋白质,用pdquest软件分析图谱,比较差异蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry,malditofms)得到相应肽质指纹图谱,用mascot查询软件搜索数据库,鉴定部分差异蛋白质。结果:成功建立了cia大鼠模型,获得分辨率较高、重复性较好的大鼠滑膜组织双向电泳凝胶图谱。正常组与25、35和45天模型组大鼠滑膜组织凝胶图谱的平均蛋白质点数分别为1 070±41、1 049±22、1 079±44和1 088±39。在4个组均有表达差异的蛋白质点中随机取20个点进行肽质指纹图分析,鉴定了部分与细胞代谢、信号转导及结构相关的差异表达蛋白质。结论:建立了分辨率较高且重复性较好的正常大鼠与cia大鼠不同时间点滑膜组织的双向凝胶电泳图谱,鉴定了一些与cia大鼠滑膜病变相关的差异表达蛋白质,为识别ra病变相关蛋白质及推断ra病变过程奠定基础。
【关键词】 胶原诱导关节炎 蛋白质组 双向凝胶电泳 malditofms
two dimensional gel electrophoresis and comparative proteome analysis of collageninduced arthritis(cia) rat synovium
xie wei, liang qinghua, yang bo, cai ying, he jinhua, guan yongjun, zuo xiaoxia.
combined chinese and western medicine institution, xiangya hospital, central south university, changsha 410008, china
[abstract] objective:to establish collageninduced arthritis rat model similar to ra pathogenesis, compare and conduct different proteomic analysis between normal rats and cia rats synovium, and thus identify proteins related to cia rat pathological synovium, as well as better understand pathogenesis of s:collageninduced arthritis rat model with cow ⅱ collagen and complete freud adjuvant was established; synovial proteins were extracted, and two dimensional electrophoresis was used to separate total proteins from normal and model rat synovium. having been stained, proteins were analyzed by pdquest software. some selected protein spots were identified by peptide mass fingerprint(pmf) based on matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry(malditofms) and s:cia rat model was established successfully. 2de patterns with high resolution and reproducibility from rat synovial proteins was obtained. the average spots of normal, 25, 35 and 45day rat synovial proteins were 1 070±41,1 049±22,1 079±44 and 1 088±39. 20 protein spots chosen randomly from normal and model groups were identified by pmf, some of which were related to cell metabolism, signal transduction and so sion:well resolved and reproducible 2de profiles of normal and cia rat synovium in different stages have been established, and some differently expressed proteins concerning cia rat synovitis has been identified. the results may provide a basis for further research of ra pathogenesis.
[key words] ra;protein profile;2de;malditofms
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, ra)是以慢性多关节滑膜炎、骨及软骨破坏为主要特征的全身自身免疫性疾病,全球发病率约为0.5%~3%,其病理基础主要是滑膜和关节等全身结缔组织的破坏和解聚。目前已从基因水平进行了大量的研究,基因的功能是通过mrna和蛋白质来体现的,但mrna水平的基因表达并不能完全代表蛋白质水平的状况,而且蛋白质还存在着翻译后修饰、转移定位、构象变化等特点,因此有必要从组织和细胞内整体蛋白质的组成、表达和功能模式来研究ra的病变过程,寻找与ra相关且具备特异性的生物标志,从而揭示ra病变的分子机理,并找到相应的治疗药靶[1]。
胶原诱导关节炎(collageninduced arthritis, cia)大鼠与ra病理机制类似, 加之对自身免疫的敏感性, 是常用的实验模型[2]。我们建立了与ra类似、可反映ra病变的cia大鼠模型,摸索了cia大鼠滑膜蛋白质样本制备方法,应用固相ph梯度双向凝胶电泳技术分离了滑膜组织的总蛋白,比较分析了不同组间差异蛋白质的表达,并对部分差异表达的蛋白质进行了鉴定,为从蛋白质水平研究ra病变过程奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 二喹啉甲酸(bca)蛋白定量试剂盒为pierce公司产品;硫脲、二硫苏糖醇(dtt)、碘乙酰胺为sigma公司产品;固相ph梯度干胶条( ph 3~10, 24 cm)、ipg缓冲液(ph 3~10)、两性电解质、覆盖液、低分子量标准蛋白质marker为amersham biosciences公司产品;尿素为usb公司产品;丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺、甘氨酸、tris、chaps、 sds为promega公司产品;碳酸氢铵、edta为国产分析纯;牛ⅱ型胶原和完全福氏佐剂购自sigma公司。
1.1.2 仪器 ipgphor等电聚胶仪、imagescanner扫描仪、daltetan垂直电泳槽、pdquest分析软件(version 7.3)、malditofms质谱仪均为amersham biosciences公司产品;酶标仪为biotek公司产品。
1.1.3 实验动物 40只sd大鼠,雌雄各半,年龄为40~50天,体重(150±30)g,购自中南大学湘雅医学院动物实验中心。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组 40只大鼠随机分为4组:①正常对照组(正常组,n=10);②模型对照组(25、35和45天,每组各10只)。
1.2.2 大鼠关节炎模型建立 将10 mg牛ⅱ型胶原(bⅱc)与5 ml完全福氏佐剂研磨均匀后,以每只100 μl从大鼠尾根部皮内注射免疫,21天后按上述方法和剂量再次免疫。
1.2.3 关节症状评分 采用关节指数积分法评定[3]。依据为关节红肿程度和范围以及关节肿大变形情况。0分:无关节炎;1分:有红色斑点后轻度肿胀;2分:关节部位中度肿胀;3分:关节严重肿胀;4分:关节严重肿胀且不能负重。关节指数积分越高,关节症状越重。
1.2.4 he染色 正常组与模型组取大鼠关节,在10%甲醛溶液中浸泡固定,石蜡包埋,切片后进行he染色。
1.2.5 大鼠滑膜总蛋白抽提
1.2.5.1 组织样品的处理 分别于造模后第25、35和45天分批处死动物。在无菌状态下,在冰上剥离大鼠滑膜,去除致密结缔组织,用生理盐水反复冲洗,去除血液和肌腱等组织。处理后的样品置于-80℃保存。
1.2.5.2 组织总蛋白抽提 30~50 mg样品置于400 μl裂解液(7 mol/l尿素,2 mol/l硫脲,2%np40,1%triton x100,100 mmol/l dtt,4%chaps,0.5%edta,40 mmol/l tris,2%pharmalyte),置于ep管中充分捣磨,充分涡旋,置于室温孵育1小时,然后充分涡旋,以4℃、12 000 r/min离心1小时,然后用bca蛋白质定量试剂盒测定浓度。
1.2.5.3 固相ph梯度双向凝胶电泳 第一向固相ph梯度等电聚胶电泳按照gorg的方法进行[4]:将已测定浓度的滑膜蛋白样品与水化液(8 mol/l尿素,4%chaps)dtt 0.001 35 g,ipg buffer 2.25 μl,共450 μl充分混合,加入ipg胶条槽,将ipg干胶条除去保护膜后,胶面朝下放入胶条槽,加上覆盖液,并盖好胶条槽盖,置于ipgphor等电聚胶仪上。在20℃进行ipg干胶条水化和聚焦,30 v低电压水化14小时,500 v 1小时,1 000 v 1小时, 最后8 000 v进行8.5小时等电聚焦,总电压时间积为69 920 vhr。第一向等电聚焦结束后,取出ipg胶条置于10 ml平衡液a[50 mmol/l trishcl(ph 8.8), 6 mol/l尿素,30%甘油,1%sds,0.2%dtt]和10 ml平衡液b[50 mmol/l trishcl(ph 8.8), 6 mol/l尿素,30%甘油,1%sds,3%碘乙酰胺]中分别平衡15分钟。
将平衡后的胶条移至12.5%均匀分离胶,使第一向胶条与第二向凝胶接触面紧密结合,用0.5%琼脂糖封胶,在酸性端放置蛋白质marker。待琼脂糖胶凝固冷却后,放入第二向电泳槽中。设置:恒功率2.5 w/胶电泳30分钟,然后设置恒功率15 w/胶进行电泳,至溴酚蓝跑至最底端约0.5 cm处停止电泳。
1.2.5.4 染色 考染:用改进的胶体考染法染色,加入脱色液(20%乙醇)至背景完全脱色[5]。银染:按照双向电泳手册的方法稍加改动后进行[6]。
1.2.6 凝胶图像分析 用imagescanner扫描仪扫描考染的凝胶,用pdquest图像分析软件依次进行点检测、背景消减、2d校正、匹配、量化获取斑点相关信息,建立平均凝胶等分析。斑点位置的重复性按照corbett等[7]的方法进行计算。所有数据统计分析在spss 11.0软件和excel上进行。
表1 酶解步骤(略)
tab.1 trypsin digestion process
1.2.7 质谱分析 随机选取差异明显、分辨较好的蛋白质点,做好标记,将切割下的蛋白质点置于eppendorf管中,质谱分析步骤见表1。
取上清用millipore公司的ziptipc18微柱脱盐,与饱和基质液cca混合,点样于不锈钢板上。制备好的样品在voyagerde str malditofms仪上分析,采用反射模式,正离子谱测定,离子源加速电压为20 000 v,反射电压比为1.12,n2激光波长为337 nm,脉冲宽度为3 ns,离子延迟提取100 ns,真空度为4×10-7 torr,质谱使用胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正和外部校正,获得肽质量指纹图。
1.2.8 数据库查询 采用matrixscience公司的mascot软件搜索数据库。肽质量控制在800~4 000,肽片段质量最大误差控制在0.05%,酶解片段不完全选择为1个,物质来源为大鼠,离子选择[m+h]和monoisotopic,半胱氨酸经碘乙酰胺处理(carbamidomethylcys),信号峰采用mascot distiller软件识别。
2 结果
2.1 一般情况观察 模型组大鼠较正常组饮食减少,体重减轻,毛发干枯。模型组大鼠于免疫后第7天双后肢出现轻度肿胀,第10天红肿加重,部分关节表面皮肤充血发亮。再次免疫后,随着时间延长,模型组大鼠症状继续加重,在后期出现负重困难,关节活动障碍。随着免疫时间延长,模型组关节炎指数积分增加。
2.2 大鼠滑膜组织病理组织学观察 见图1。正常滑膜组织特点:未见明显的新生血管和炎症细胞浸润。模型组大鼠炎症滑膜特点:滑膜增厚,微血管增生,炎症细胞浸润,且随着25、35和45天时间增加,关节症状加重,新生血管逐渐增多,血管翳生成。
图1 正常组和模型组大鼠滑膜组织病理切片(he染色)(略)
fig.1 normal rat and model rat synovium tissue pathology slice
note: rat synovium tissue(40×);b.45 days model rat synovium tissue(40×).
图2 银染双向凝胶电泳图与考染双向凝胶电泳图(略)
fig.2 two dimensional electrophoretic map of gels stained with silver and coomassie brilliant blue
note: dimensional electrophoretic map of gels stained with silver of 35 days model rat synovium tissue; dimensional electrophoretic map of gels stained with coomassie brilliant blue of 35 days model rat synovium tissue.
图3 正常与模型组大鼠滑膜双向凝胶电泳参考图谱(略)
fig.3 two dimensional electrophoretic map of normal rat and model rat synovium tissue
note: dimensional electrophoretic map of normal rat synovium tissue; dimensional electrophoretic map of 45 days model rat synovium tissue.
2.3 模型组大鼠双向凝胶电泳银染图谱与考染图谱比较 通过软件分析,银染凝胶图谱得到1 248±38个蛋白质点,考染凝胶图谱得到923±41个蛋白质点,见图2。银染双向凝胶电泳图与考染双向凝胶电泳图比较(银染和考染上样量均为800 μg),前者分辨率及灵敏度更高。
图4 cia大鼠关节滑膜蛋白质电泳图谱3号蛋白质点肽质量指纹(略)
fig.4 peptide mass fingerprinting of protein spot no.3 in 2de map of cia rat synovium tissue
表2 cia大鼠与正常大鼠关节滑膜组织差异蛋白质点鉴定(略)
tab.2 differential protein spots of cia rat synovium tissue and normal rat synovium tissue
2.4 模型组和正常对照组大鼠滑膜组织双向凝胶电泳参考图谱 采用imagescanner扫描仪扫描,获得了分辨率较好的双向凝胶电泳参考图谱,见图3。在相同条件下对同一标本的滑膜蛋白进行了3次双向电泳重复性检测,发现3次双向电泳图谱相似。通过分析点检测,得到正常对照组及模型组25、35和45天各时间点的平均蛋白质点数分别为1 070±41、1 049±22、1 079±44和1 088±39。
经过pdquest软件分析,背景消减,以其中一块胶作为参考胶进行匹配,得到正常对照组及模型组25、35和45天各时间点平均蛋白质点数分别为1 018±37、1 001±20、1 012±41和1 008±34。正常对照组及模型组25、35和45天各时间点匹配率分别为96.1%、94.4%、95.5%和95.1%。
图5 cia大鼠与正常大鼠关节滑膜组织差异蛋白质点的表达(略)
fig.5 two dimensional electrophoretic map of differential protein spots of cia rat synovium tissue and paired normal rat synovium tissue
note:the gel was stained with coomassie brilliant blue, ph 310 ipg strip, arrowheads stand differential protein spots of cia rat synovium tissue and normal rat synovium tissue.
再任意选取同一模型组的3块胶互相匹配且分辨清晰的50个蛋白质点,选取中间位置的点为原点,以参考胶为参考位置,测量其它2块胶对应点在第一向ief和第二向sdspage方向上位置的偏差。3块胶在位置上有较好的重复性,不同胶的蛋白质点在ief方向的偏差为(0.785±0130)mm,在sdspage方向上的偏差为(0.982±0.153)mm。
2.5 蛋白质点的鉴定 从正常组与模型组表达差异(差异大于2倍)的蛋白质点中(图5),选取了20个丰度较高、分辨清楚且在各个组中均有相同变化的点进行malditofms分析,利用mascot查询软件搜索。分数超过55被认为有统计学意义,共获得19个肽质量指纹图,1个无质谱结果,16个搜索到具有统计学意义的蛋白质。图4是3号蛋白质点的肽质量指纹图。通过查询mascot,初步鉴定的蛋白质按其功能进行初步分类,主要有以下几种:①基本代谢相关的蛋白;②信号转导蛋白;③电子传递相关的蛋白;④假定或未知蛋白;⑤细胞骨架蛋白;⑥抗氧化蛋白。
3 讨论
蛋白质组学技术以其高通量、高灵敏度等特点在后基因组时代发挥着独特优势。目前与ra相关的蛋白质组研究较少,kumar等[8]用二维电泳的方法对成纤维样滑膜细胞进行研究,鉴定了254个蛋白质点。但成纤维滑膜细胞培养在体外进行,其蛋白质表达与ra病变过程中的蛋白质变化存在差异。我们对cia大鼠滑膜组织进行分析,以推断在ra和正常滑膜组织间表达存在差异的蛋白质。在组织标本采集方面,尽量去除血液、肌腱等其他成分,以获得较纯净的滑膜组织。我们摸索了组织总蛋白的抽提方法,建立了重复性较好的正常大鼠和cia大鼠滑膜组织的双向凝胶电泳图谱。在样品制备、二向胶制备以及考马斯染色时尽量保持同一性。在电泳过程中,我们将等电聚焦的电压设置为30、100、500、1 000和8 000 v,使电压逐步上升,在一定程度上减少了上样量及盐离子对等电聚焦的影响。
虽然银染图谱分辨率及灵敏度较强,但由于上样量有限,肽质量指纹图谱信噪比低,质谱出峰率以及检测均不如考染图谱。因此我们选择了考染图谱进行酶解以及肽质量指纹图谱分析,经过检索,得到了较为满意的结果。
本实验运用malditofms对正常组和模型组大鼠滑膜组织的差异蛋白质点进行初步分析,发现了部分差异表达蛋白质点,见表2、图5。这些蛋白主要包括6类:①基本代谢相关的蛋白:②信号转导蛋白;③细胞骨架蛋白;④抗氧化蛋白;⑤电子传递相关的蛋白;⑥假定或未知蛋白。
3.1 基本代谢相关的蛋白 表2鉴定的差异蛋白中,apolipoprotein、fructosebisphosphate aldolase a、nucleoside diphosphate kinase、guanine nucleotidebinding protein等属于该类蛋白。在以前的报道中,载脂蛋白(apolipoprotein)与脂质代谢紊乱和心血管疾病极为相关,如维系高密度脂蛋白(hdl)的结构,参与hdl受体的识别,激活卵磷脂胆固醇酯酰转移酶(lcat)等[9]。蛋白apoa在模型组中的表达高于正常组。bresnihan等[10]的研究表明,apoaⅰ 在血浆中减少而在滑液中增多,提示apoaⅰ 的变化可能与ra活动性相关。且apoaⅰ对il1β和tnfα有阻断作用,它在局部炎症组织的表达,可能是一种阻断前炎症细胞因子产生和局限ra复发的机制。apoaⅰ究竟以何种方式阻断il1β和tnfα的产生,进而抑制炎症反应,值得进一步探索和证实。
醛缩酶aldolase在糖酵解中起着解聚和浓集的作用,aldolase a在多种组织中表达,aldolase b在肝肾组织中表达,aldolase c在脑组织中表达。在ra病人的血清中鉴定出的aldolase与骨侵蚀和关节破坏相关[11]。本实验结果中模型组aldolase表达较高,推测其机理很有可能是在aldolase a的结构发生变化时产生了抗aldolase a的自身抗体。
3.2 信号转导蛋白 表2中annexin ⅱ、annexin ⅰ、peptidylprolyl isomerase a为此类蛋白。annexin s是一类钙依赖的、磷脂结合蛋白家族,具有调节磷脂酶a2活性、炎症反应、胞吐、分化、增殖、血凝、免疫应答,以及细胞骨架连接和细胞内信号转导等功能,且annexin ⅰ表达与肿瘤发生发展有关,annexin ⅰ在肝癌组织、乳腺癌组织、食管癌组织、肺癌组织中均有高表达[1214]。在ra中,annexin ⅰ是一种内生抗炎介质,研究表明内生的annexin ⅰ抑制了tnfα、pge2和no的产生[15]。在我们的研究中,annexinⅰ在模型组中的表达高于正常组,其机理可能是annexin在滑膜炎症过程中起着调节免疫的作用。
3.3 细胞骨架蛋白 表2中核纤层蛋白lamins属于中等纤维蛋白家族(if),其多聚体组成网格状结构,紧贴于内层核膜内表面,在维持核的正常形态、提供染色质锚着点、核周期性的解体和重组装过程中发挥重要作用。蛋白内部不同位点的缺失和突变可引起不同的临床综合征[16]。lamins基因的缺失和突变可损害骨骼肌、心肌、肌腱和脂肪组织,其机理可能为lamins蛋白和其他内层核膜蛋白是caspases的关键底物,它们的突变造成核膜形态改变,使得细胞对凋亡更加敏感[17]。另一种假说认为内层核膜蛋白与染色质的相互作用可能会影响组织特异的基因表达,突变会造成肌肉和脂肪组织的必需蛋白表达量的改变[18]。本实验模型组lamins的高表达,提示滑膜及软骨的侵蚀破坏可能与该蛋白相关。
3.4 抗氧化蛋白 表2中鉴定的差异蛋白peroxiredoxin 1、peroxiredoxin 2属于这一类蛋白。peroxiredoxin属于抗氧化蛋白家族,广泛存在于原核生物和真核生物中,哺乳动物的peroxiredoxin家族包括6个成员,prx ⅰ和prx ⅵ在多种组织中表达,是一个可诱导蛋白,并高表达于一些恶性肿瘤细胞中。peroxiredoxin通过硫氧还原蛋白还原过氧化物或者超氧化物,在消除代谢产生的过氧化物中起着重要作用,并且通过调节细胞内过氧化氢的浓度参与细胞因子信号的级联放大[19,20]。本实验鉴定的peroxiredoxin ⅰ在模型组中的表达高于正常组,提示在自身免疫疾病也存在氧化应激这一病理过程。而抗氧化剂酶(antioxidative enzymes)在这一过程中起着重要作用,因为针对该酶的自身抗体很有可能加剧了自身免疫反应。已有报道指出,peroxiredoxin等在自身免疫疾病中起着重要作用[21]。
其它如假定或未知蛋白质在ra中的作用不甚明确,需进一步研究。
本实验鉴定的蛋白质与以前报道的与ra相关的基因在rna水平的表达有一定差异,其原因可能为:①基因的表达并不是完全按1∶1的比例在蛋白质水平表达。②蛋白质的表达还受到rna翻译后修饰的制约[22]。虽然鉴定的差异蛋白种类较多,但预想的tnf、il等与ra关系密切的蛋白并未被检出,其原因可能与它们的低丰度表达有关。
本实验对cia大鼠与正常大鼠的差异蛋白做了初步鉴定,仍需其他技术如western blot以及串连质谱等进一步证实结果的可靠性。另外cia动物模型与实际病人的ra病理过程仍存在一定差异,需要进一步的研究,以探索ra的病理过程以及治疗的方法。本实验中发现的蛋白质,如与基本代谢相关的酶,信号转导蛋白,在其他组织蛋白质组学的研究中也有改变,究竟这些蛋白质是作为病因导致了相同的病理过程,还是这些病理改变导致了蛋白质的变化,值得进一步研究。
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