【摘要】 目的: 采用磁微粒分离酶联免疫荧光（meif）分析技术建立一种简便、 高敏感性、 定量检测人血清胰岛素(insulin)的新方法。方法: 选用2株识别人胰岛素不同表位的单克隆抗体(mab)。一株mab用异硫氰酸荧光素（fitc）标记, 另一株用碱性磷酸酶(ap)标记; 偶联羊抗fitc抗体的磁珠用作固相分离载体, 4-甲基磷酸伞型酮用作荧光底物。结果: 成功建立了定量检测人血清胰岛素的meif, 灵敏度2.0 μiu/ml, 线形范围0～188.52 μiu/ml, 批内变异系数(cv)为4.3%～5.2%, 批间cv为2.6%～9.5%, 稀释回收率为93%～117%, 加标回收率为94%～113%。实际样品的测定结果与倍爱康公司商品化人insulin磁分离发光系统检测试剂盒的检测结果比较, 具有良好的相关性。结论: meif定量测定人insulin方法成本低、 灵敏度高、 稳定性好, 在临床免疫检测领域具有广阔的应用前景。
【关键词】 酶联免疫分析 免疫荧光 4-甲基磷酸伞型酮 磁珠 胰岛素
establishment of the magnetic separation enzyme immunofluorescence method for detecting insulin
xie jing, liu zhen-shi, hu shan, cai ru-xiu, yang hai, yang xiang-liang*
college of life science and technology, huazhong science and technology university, wuhan 430070, china
［abstract］ aim: to establish a convenient and sensitive magnetic separation enzyme immunofluorescence (meif) method for detecting human insulin. methods: two monoclonal antibodies (mabs) were conjugated with fitc and alkaline phosphatase (ap) respectively, which were incorporated magnetic solid phase separation. magnetic beads were coupled with sheep anti-fitc antibody as solid phase and 4-methylumbelliferyl-phosphoric acid (4-mup) was used as substrate to set up melf for detecting insulin. results: the sensitivity of this assay was 2.0 μiu/ml, the linear range was from 0 μiu/ml to 188.52 μiu/ml, and the intra-assay variation and inter-assay variation were 4.3%-5.2% and 2.6%-9.5%, respectively. the recovery rate of dilution was 92.6%-117% and the recovery rate of accession was 106%-121%. the result of the assay correlated well with that of magnetic enzyme chemiluminescence immunoassay system. conclusion: the meif for detecting insulin is low at cost, sensitive, specific and stable, which can be widely used in clinical immune detection.
［keywords］enzyme immunoassay; immunofluorescence; 4-methylum-belliferyl-phosphoric acid; magnetic beads; insulin
糖尿病是我国最常见的内分泌疾病, 发病率约为1.3‰, 我国每年约有2.7万新增患者。糖尿病给患者家庭和社会带来巨大的经济损失（每年高达100亿人民币）和沉重的精神伤害［1］。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变, 糖尿病发病趋于年轻化［2］。血清胰岛素（insulin）含量测定是糖尿病诊断和治疗过程中重要的血清检查项目, 对于糖尿病的诊断和治疗具有重要意义。常规检测胰岛素的方法主要有放射免疫法和酶联免疫吸附法等, 但存在着放射污染或灵敏度低, 操作复杂等不足。本研究旨在建立一种检测人血清胰岛素的新方法-磁分离酶免疫荧光法(magnetic enzyme immunofluorescence, meif), 实现对人血清胰岛素的定量、 敏感和快速检测。
1 材料和方法
1.1 材料 4-甲基磷酸伞型酮（4-mup）购自sigma公司。磁分离试剂、 洗液、 胰岛素标准品及抗人胰岛素单克隆抗体（mab）fitc和ap连接物由北京倍爱康生物技术有限公司提供。二乙醇胺（dea）和三乙醇胺（tea）购自fluka公司。victorⅲ型荧光检测仪为珀金埃尔默(perkinelmer)公司产品。专用于酶标板的磁分离器为自行研制。 恒温箱为上海实验仪器公司产品。白色未标记酶标板为greiner microlon生产。
1.2 方法
1.2.1 mab标记物的工作浓度选择 将倍爱康公司提供的fitc标记抗人胰岛素mab1和ap标记mab2, 用tris缓冲液稀释至不同浓度, 以检测灵敏度高、 非特异结合低为原则［3］选择标记抗体的最佳工作浓度。
1.2.2 探索meif检测人胰岛素的最佳条件 通过对ap催化4-mup反应条件的探索、 优化; 对各种检测条件如标准品、 磁分离试剂、 荧光底物和标记抗体用量, 温育时间等条件进行全面探索后确定检测的最佳条件。
1.2.3 meif检测人胰岛素方法的性能评价 通过实验对本检测方法的灵敏度、 线形范围、 回收率、 测定血清稳定性等进行了评价, 并与倍爱康生物技术公司人胰岛素试剂盒比较, 明确该方法与现有商品化检测试剂盒的相关性。
2 结果
2.1 荧光的动力学性质 在ap和4-mup荧光体系中, 将不同浓度的ap加入荧光底物中, 荧光强度(fli)随ap的浓度和反应时间而变化。fli随反应的时间延长而增强。ap浓度在1 mg/l时, 反应较快, 180 s左右, fli接近峰值, 随后开始缓慢下降; 但浓度低10个数量级以下时, 反应10 min, fli还未到峰值。fli与ap浓度和反应时间关系参见图1。
图1 酶促荧光反应的动力学曲线（略）
fig 1 kinetics curves of enzyme-accelerating fluorescence-scence reaction
a: 1 mg/l ap; b: 0.1 mg/l ap; c: 0.01 mg/l ap.
2.2 荧光的反应条件
2.2.1 ph值对反应速度和fli的影响 ap的适宜工作ph值为10～11［4］, 而实验显示4-mup在低ph值条件下易出现非酶水解而使本底增高。本研究中, 分别以ph8.0、 8.6、 9.0、 9.5、 9.8、 10.0和11的dea缓冲液配制荧光底物溶液, 考查ph对fli的影响。实验发现不同ph底物与浓度相同的ap（1 mg/l）反应, fli峰值基本一致, ph11时反应达到峰值用时最短(图2)。
图2 ph值对rli的影响（略）
fig 2 effect of ph on rli
a:ph8.0; b:ph8.6; c:ph9.0; d:ph9.5; e:ph9.8; f:ph10; g:ph11.
2.2.2 底物浓度对fli的影响 用ph11的dea缓冲液配制不同浓度的4-mup底物溶液, 各取200 μl与10 μl ap(1×10-1 mg/l)于25℃反应10 min后测定fli (图3)。实验表明, 4-mup浓度在0.125 mmol/l以下时, rli随底物浓度的增加而接近线性增加, 当底物浓度大于等于0.125 mmol/l时, fli趋于平缓, 故本实验采用4-mup底物的浓度为0.125 mmol/l。
图3 底物浓度对fli的影响 （略）
fig 3 effect of substrate concentration on fli
a: 0.1 mmol/l; b: 0.125 mmol/l; c: 0.2 mmol/l; d: 0.25 mmol/l; e: 0.3 mmol/l; f: 0.5 mmol/l.
2.3 确立的检测方法 不同浓度的人胰岛素标准液（a-f标准点浓度分别为0 μiu/ml、 11.36 μiu/ml、 23.22 μiu/ml、 55.61 μiu/ml、 126.36 μiu/ml、 188.52 μiu/ml）、 质控液及待测血清样品用量分别为30 μl/孔, 连接fitc和ap的抗人胰岛素mab工作浓度分别为1.4 mg/l和2.0 mg/l, 用量分别为15 μl/孔。将三者加入检测孔底部并混匀后, 37℃温育30 min。各孔（包括空白孔）加入磁分离剂40 μl, 充分混匀后, 37℃温育10 min。将反应板安置在磁分离器上分离2 min, 倾倒上清液。磁珠用洗液清洗3次, 每孔加洗液150 μl。最后加入4-mup工作液150 μl/孔。混匀时开始计时, 混匀30 s, 室温反应15 min, 在磁分离器上分离2 min后, 检测荧光强度。采用四参数拟合标准曲线, 计算样品中胰岛素的含量(μiu/l)。标准曲线参见图4。
图4 meif检测insulin标准曲线（略）
fig 4 insulin calibration curve by meif
2.4 对meif的评价
2.4.1 灵敏度 同时测量20次0浓度标准品, 计算均数（x）和标准差（s）, 将x+s值输入上述曲线拟合程序中, 求出其浓度为理论检测的最小量, 即灵敏度［5］。本实验测得灵敏度是2.0 μiu/ml。
2.4.2 精密度 选取低、 中、 高3种浓度的insulin标本液12 μiu/ml、 36 μiu/ml、 120 μiu/ml, 分别对每个浓度进行15次重复, 计算各个浓度点的均数（x）和标准差（s）, s/x即为变异系数（cv）。实验表明, 该方法批内cv在4.3%～5.2% 。对3份不同浓度的insulin标本液分别进行3次检测, 每次检测各浓度5次重复, 实验显示批间cv为2.6%～9.5%。
2.4.3 回收率 把一定含量的标准insulin抗原随机加入到3份样品中测定其insulin含量, 计算回收率为93%～117%。将4份不同浓度的insulin高值血清作1∶1～1∶16稀释后, 测定insulin的含量, 平均回收率为106%～121%。
2.4.4 对比试验 同时用建立的磁分离荧光法和倍爱康公司的磁分离发光法检测50例患者血清中insulin的含量, 显示相关性良好(r2=0.9798)。
2.4.5 测定血清标本的稳定性 加入反应底物后分别在10、 15、 20、 25、 30 min内, 检测高、 中、 低3份含不同浓度insulin的患者血清, 分别为(150.90±1.80) μiu/ml、 (86.40±1.80) μiu/ml和(17.62±0.42) μiu/ml, cv分别为0.4%、 1.3%和2.4%。
3 讨论
meif是将荧光测定技术引入磁分离酶联免疫检测系统中而建立的一种方法。该法中所用的荧光底物4-mup与ap作用, 其磷酯键分解, 脱磷酸根基团后形成4-甲基伞型酮(4-mu)。它在360 nm激发光的照射下, 发出448 nm的荧光, 通过荧光分析仪可检测［6］, 并且无放射污染。其较高的荧光值降低了背景干扰,提高了信噪比, 增加了检测系统的灵敏度。4-mup-ap荧光体系是已知最方便和灵敏的荧光分析系统之一, 通过本次实验检测, 对标记物 ap的检测限可达10-15 mol/l, 整个反应过程不超过1 h。目前, 由于商用化学发光底物完全依赖进口, 且价格昂贵, 高质量的低成本免疫荧光技术难于实现。4-mup作为荧光检测底物, 不但进口价格低廉, 还能够实现自行合成。采用板式反应模式, 方便适用于任何一款板式荧光检测仪。我们建立了用meif检测人胰岛素的方法, 并进行了初步鉴定。结果显示, 当底物浓度为0.125 mmol/l时, 既能长时间保存7～8个月, 又能充分满足反应体系中ap的含量, 并且随着待测物浓度的增加, 与荧光值呈现良好的线性关系, 具备较高的灵敏度, 能够满足检测的要求。而且该法批内及批间的cv%较小。经初步应用, 该法与发光法的相关性良好, 为该法的推广应用提供了实验依据。
【参考文献】
［1］ 邓尚平, 叶秀伦, 吴 桐, 等. 临床糖尿病学［m］. 四川科学技术出版社, 2000: 1-3.
［2］ 姚姣娟, 马惠风. 城市社区居民糖尿病流行病学调查［j］. 实用医技杂志, 2006, 13(6): 982-984.
［3］ 王东琳, 刘雪松, 金伯泉, 等. 一种高度敏感检测tnf的磁分离酶联免疫法［j］. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(1): 94-95.
［4］ 焦 奎, 张书圣. 酶联免疫分析技术与应用［m］. 化学工业出版社, 2004: 67-68.
［5］ 尹伯元, 王仁芝, 李振甲, 等. 标记免疫学［m］. 原子能出版社, 1998: 120-122.
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