【摘要】 幽门螺杆菌(hpylori,hp)是慢性胃炎,消化性溃疡的重要致病因素。研究表明,hp的根治和清除有利于溃疡的治愈。而hp耐药直接影响hp的根治和清除,hp耐大环内酯类药物(克拉霉素)的机制与其23s rrna的v区上的点突变有关。随着hp耐药率的逐年升高,有关hp的耐药分子机制和检测技术成为研究热点。因此,开展hp耐药的相关研究对hp的诊断和治疗有重大意义。
【关键词】 幽门螺杆菌;耐药性;克拉霉素;分子机制
克拉霉素是新一代的大环内酯类抗生素,由于其抗hp作用强,而成为根除hp治疗方案中的主要药物。但hp可对其产生耐药性,耐药菌株的出现是导致根除治疗失败的主要原因[1-3]。我国近年才开始应用克拉霉素,hp原发耐药菌株的出现可能主要与同类药物交叉耐药有关,治疗失败时大约1/2~2/3的菌株可对其产生获得性耐药。因此,研究hp的耐药情况、耐药机制和检测手段对指导临床用药以及疗效监测显得十分必要。本文就hp对克拉霉素耐药作一综述。
1 hp对克拉霉素的耐药情况
随着克拉霉素的广泛使用,hp的耐药菌株也逐渐增多。hp对克拉霉素耐药率在不同的国家和地区情况不尽一致。kobayashi等人[4]研究发现日本的hp克拉霉素耐药率从2002年的18.9%上升到2005年的27.7%,且有明显的性别差异(p<0.0001),其中男性19.2%,女性27.0%。他们还发现克拉霉素耐药率有地区差异。kato等人[5]报道日本儿童的2002年克拉霉素原发耐药率为29.0%,hp敏感菌株和耐药菌株的根除率分别为89.0%、56.0%。hp继发耐药率(78%)明显高于原发耐药率(p<0.01)。kimet等人[6]报道韩国汉城hp克拉霉素耐药率由1994年的2.5%上升至2003年的13.8%。toracchio等人[7]对意大利中部研究发现克拉霉素原发耐药率和继发耐药率分别为23.4%、82.3%,克拉霉素原发耐药多见于女性。elviss等人[8]报道北威尔士2004年的克拉霉素耐药率为7%,明显低于欧洲其他地方。koivisto等人[9]报道芬兰的克拉霉素耐药率仅为2%,且与有口腔和呼吸道疾病的用药史有关。boyanova等人[10]认为保加利亚的儿童克拉霉素耐药率和他们的居住地有关,这种差异可能和当地使用大环内酯类药物有关,居住在乡村的儿童克拉霉素耐药率为22.7%,明显高于居住在大城市的儿童耐药率(8.5%)。osato等人[11]分别用etest和agar dilution方法研究发现美国的克拉霉素原始和继发耐药率分别为12%和10.6%,性别和年龄对克拉霉素耐药有很大影响。kaneko等人[12]研究显示在经过多重抗生素(包括克拉霉素)治疗的非结核性呼吸道感染患者的克拉霉素耐药率高达100%,提示应在进行长期的抗生素治疗前应根除hp。onder等人 [13]对土耳其110例hp感染者研究发现,hp的克拉霉素耐药率为48.2%,但其耐药率和性别、年龄、大环内酯类药物的使用、居住地、教育状况无相关性。go?ciniak等人 [14]研究发现波兰1997-2001年的克拉霉素原发耐药率8.6%,治疗8周后耐药率达17.6%。中国地区也存在着地区和年龄的差异,成虹等人[15]调查发现北京1999-2000年的克拉霉素耐药率为10.0%,2000-2001年为18.3%,存在着上升趋势。陈洁等人[16]对浙江地区44例儿童临床分离菌株研究显示克拉霉素耐药率为18.2%,儿童耐药率高于成人。hao等人[17]2004年报道中国东北地区克拉霉素耐药率为23.3%。
综上所述:(1)各国家或地区的hp菌株对克拉霉素原发耐药率不同,耐药率为2%-48%,有明显的地域差异。克拉霉素耐药率在汉城、北京、日本、土耳其呈上升趋势,在意大利、芬兰、北威尔士呈相对稳定状态或下降趋势。(2)尽管有报道儿童克拉霉素耐药率高于成人,但克拉霉素耐药是否存在年龄、性别等差别,还存在争议。(3)目前多数学者认为,克拉霉素继发耐药率明显高于原发耐药率,抗生素(大环内酯类)的用药史与hp交叉耐药、继发性耐药率的上升有相关性。
2hp对克拉霉素的耐药机制
克拉霉素为14环的半合成新大环内酯类,因结构上其内酯环的6位羟基为甲氧基所替代,也称甲红霉素。这一结构上的修饰增加了其对酸的稳定性及抗菌活性。其作用于细菌核糖体50s亚单位,通过阻断转肽作用及mrna位移而抑制细菌蛋白质的合成。作为根除hp治疗方案的关键成分,对该药的耐药是治疗失败的主要原因。bazzoli等人[18]报道克拉霉素敏感株及耐药株的根除率分别为95%和40%。大环内酯类抗生素能结合在野生型hp的50s大亚基的23s单位上,抑制肽基酰基转移酶,影响核蛋白位移,抑制细菌蛋白合成和肽链延伸。而有耐药性的hp的23srrna 的v 区上发生了点突变,导致核糖体的构象改变,使大环内酯类抗生素结合位点也随之发生改变,进而使hp与大环内酯类药物亲合能力减粥,药物也就不能阻止细菌的蛋白合成,最终产生耐药。最多见的突变位点为a2143g。de francesco等人[19]在对62株克拉霉素耐药菌株的研究中发现35株发生了a2143g突变(突变率为56.4%),14株发生a2142g突变,8株a2142c突变,5株为a2143g和a2142g或a2143g和a2142c的同时突变。francesco等人[20]还发现发生a2143g突变的菌株根除率最低(48%), 但发生a2142g或a2142c 突变的菌株根除率仍可达到93%,提示a2143g突变对hp对克拉霉素耐药进而影响其根除的作用最大。posteraro等人[21]应用pcr依赖的高压液相色谱法检测到5个突变位点:a2142g,a2142c,a2143g,t2182c和c2195t。其c2195t的突变先前未曾发现过,此次与a2143g同时出现,显示克拉霉素仍有新的突变位点产生,其耐药机制尚需进一步研究。
3 幽门螺杆菌耐药生物学检测方法
3.1对hp耐药的传统生物学检测方法
hp耐药的传统生物学检测方法是取胃黏膜或组织,细菌增殖培养后,进行etest、琼脂稀释法、纸片扩散法等体外药敏试验。etest操作简便,但试纸价格昂贵;琼脂稀释法技术要求较高;纸片扩散法简便易行,但结果受多种因素的影响,不够准确。hp培养要求高,时间长,不适合临床常规开展。hp耐药的分子生物学检测方法建立在检测其核糖体23s rrna点突变的基础上,根据是否需要基因扩增分为:(1)需要用基因扩增产物进行分析的,包括聚合酶链限制性片段长度多态性分析法(pcrrelp)、dna测序法(sequencing)、dna酶免疫测定法(dna enzyme immunoassay)、寡核苷酸连接试验(ola)、3'端错配反向pcr(3'mpcr)、实时荧光定量pcr(realtime pcr)、基因芯片法(gene chip)、变性高效液相色谱法(dhplc)等。(2)不需要用基因扩增产物进行分析的, 如荧光原位杂交(fish)。1996年versalovic等首先将pcrrelp用于检查hp 23s rrna的a2142g,a2143g的突变,该法以核糖体23s rrna点突变为基础,通过pcr方法扩增发生突变的区域,由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点的出现,利用特异的限制性内切酶(mboⅱ,bsaⅰ)对pcr产物进行酶切,电泳分析,然后根据dna片段长度的差异作出判断。该法简便易行,较为敏感,是检测ag突变常用的方法,但是该法的准确性受到临床标本以及非 hp dna扩增产物的影响,alarcón等人 [22]用3'mpcr可以检测的23s rrna a2142c的突变,其特点是运用一对特殊的引物。realtime pcr将杂交技术和实时pcr以及融解曲线分析法三者有机地结合在一起,此方法不易污染,不需酶切,能同时对hp感染进行定量和耐药性检测,而且适合于大量标本的检查。elviss等人 [23]用realtime pcr通过对溶解曲线的判断准确快速检测点突变,还比较了3'mpcr、realtime pcr、pcrrelp,认为用3'mpcr检测点突变其敏感度和特异度都高于另外两种方法。dhplc由oefner于1995年建立,利用杂合双链和纯合双链部分变性温度不同,可以自动检测单碱基置换,小片段插入和缺失。 posteraro等人 [24]用dhplc对pcr扩增产物进行分析,能检测a2142g,a2143g,a2123c,t2182c,c2195t五个位点的突变。临床实践证明,dna测序则是检测基因突变位点的金标准。
3.2 基因芯片技术对hp耐药的检测
近年来,基因芯片(gene chip)技术发展迅速,已广泛应用于疾病研究、疾病诊断、基因测序、药物筛选等方面。基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术的基础上的,其原理是将大量的探针分子固定在支持物上,与标记的样品dna进行杂交,可根据碱基互补配对的原则确定靶dna序列,通过激光共聚集仪扫描,检测杂交信号的强度和分布进行分析。基因芯片可以实现对上千个基因同步检测,国内外学者已经在尝试用该技术检测hp耐药基因,且对hp基因进行定性、定量及结构分析的研究。国内学者[25]制备和应用寡核苷酸芯片对hp感染及其致病性相关的基因型和耐药性同时进行检测,该法将pcr技术与高通量芯片技术相结合,对检测对象的多种生物学信息进行检测,具有快速、高效的特点,具有较高的灵敏度,同时自动化读取手段可确保检测的特异性和客观性,减少人为误差,这对多种基因的比较研究非常有利。但也存在一些问题:样品的制备与标记比较繁琐,芯片的制备较为复杂,仪器昂贵,费用较高等。随着科学技术的不断发展,基因芯片技术也会逐渐成熟和完善,基因芯片技术对hp耐药的检测有着极为广阔的应用前景。
随着各国学者对hp耐药检测技术研究的进展,取材方式也经历了一个发展过程:(1)胃镜下取胃组织或黏膜,细菌培养,提取菌株dna,再进行各种分子生物学方法检测。(2)直接从胃活检标本中提取dna,省去了培养步骤,快速简便。(3) chattopadhyay等人[26]报道不需要抽提dna的实验方法,胃镜下取胃黏膜或组织置于无菌塑料管,加120ml磷酸盐缓冲液(pbs),剧烈振荡2min,开水浴15min后冰上冷却,13000g离心1min,吸取上清液进行pcr扩增。(4)粪便取材,fontana用巢式pcr方法对粪便进行扩增[27],产物用mboⅱ,hhaⅰ,bsaⅰ进行酶切可检测a2142c/g,t2717c,a2143g的突变.粪便取材属非创伤性,但由于粪便中hp含量较低,杂菌较多,尤其是粪便中的胆红质,胆盐及一些重金属离子等可抑制taq dna聚合酶的活性,给实验带来一定的难度,如何去除抑制物是实验成功的关键.以上取材方式中,胃镜下取材适用于有内窥镜检查指征的患者,如十二指肠溃疡、早期胃癌等。粪便取材方便且无痛苦,无创伤,尤其适用于对hp的克拉霉素耐药性的流行病学查,以建立本地区的hp耐药的流行病学资料,指导临床合理用药。
4 结语
随着抗生素的广泛适用,hp的耐药率逐渐上升。目前,hp对克拉霉素耐药的分子机制已基本明确,有关耐药的检测手段的研究也较多,但大多数方法费时、繁琐。因此,研究和建立简便、快速、准确的耐药检测方法,将对建立流行病学资料和指导临床合理用药有着重要的作用。基因芯片技术可对多种基因同时、快速进行检测,且具有高通量、高灵敏度的特点,有着极为广阔的应用前景。
【参考文献】
1 realdi g, dore mp, piana a, et al. pretreatment antibiotic resistance in helicobacter pylori infection: results of three randomized controlled studies[j]. helicobacter, 1999, 4(1): 106-112.
2 pilotto a, leandro g, franceschi m, et al. the effects of antibiotic resistance on the out come of three 12 week triple therapies against helicobacter pylori[j]. aliment pharmacol ther, 1999, 13(3): 667-673.
3 megraud f. antibiotic resistance in helicobacter pylori infection[j]. br med bull, 1998, 54(1): 207-216.
4 kobayashi i, murakami k, kato m, et al. changing antimicrobial susceptibility epidemiology of helicobacter pylori strains in japan between 2002 and 2005[j]. j clin microbiol, 2007, 45(18): 4006-4010.
5 kato s, fujimura s, udagawa h,et al. antibiotic resistance of helicobacter pylori strains in japanese children[j]. j clin microbiol,2002, 40(3): 649-653.
6 kim jm, kim js, jung hc,et al. distribution of antibiotic mics for helicobacter pylori strains over a 16-year period in patients from seoul, south korea[j]. antimicrob agents chemother, 2004, 48(26): 4843-4847.
7 toracchio s, marzio l. primary and secondary antibiotic resistance of helicobacter pylori strains isolated in central italy during the years 1998-2002[j]. digliver dis, 2003, 35:541-545.
8 elviss nc,owen rj,xerry j,et al. helicobacter pylori antibiotic resistance patterns and genotypes in adult dyspeptic patients from a regional population in north wales[j]. j antimicrob chemother, 2004, 54(2): 435-440.
9 koivisto tt, rautelin hi, voutilainen me,et al. primary helicobacter pylori resistance to metronidazole and clarithromycin in the finnish population[j]. aliment pharmacol ther, 2004, 19(8):1009-1017.
10boyanova l, gergova g, koumanova r,et al. risk factors for primary helicobacter pylori resistance in bulgarian children[j]. j med microbiol, 2004, 53(6): 911-914.
11osato ms, reddy r, reddy sg,et al. pattern of primary resistance of helicobacter pylori to metronidazole or clarithromycin in the united states[j]. arch intern med, 2001, 161(9): 1217-1220.
12kaneko f, suzuki h, hasegawa n,et al. high prevalence rate of helicobacter pylori resistance to clarithromycin duringlongterm multiple antibiotic therapy for chronic respiratory disease caused by nontuberculous mycobacteria[j]. aliment pharmacol ther, 2004, 20 (supp l1): 62-67.
13onder g, aydin a, akarca u,et al. high helicobacter pylori resistance rate to clarithromycin in turkey[j]. j clin gastroenterol, 2007, 41(3): 747-750.
14goéciniak g, iwańczak b, przondomordarska a,et al. high level of resistance to metronidazole and clarithromycin in helicobacter pylori isolated from pediatric patients in poland (1997-2001)[j]. folia microbiol(praha) 2004, 49(1): 133-136.
15成虹, 胡伏莲. 北京地区幽门螺杆菌的耐药情况及其变化趋势[j]. 中华医学杂志, 2005, 39(24): 2754-2757.
16陈洁, 陈飞波, 余金丹,等. 幽门螺杆菌对克拉霉素 阿莫西林 甲硝唑体外耐药性和敏感性的初步分析[j]. 中华儿科杂志, 2004, 10(3): 769-771.
17hao q, li y, zhang zj, et al. new mutation points in 23s rrna gene associated with helicobacter pylori resistance to clarithromycin in northeast china[j]. world j gastroenterol, 2004, 10(8):1075-1077.
18bazzoli f, berrettid, de luca l, et al. what can be learnt from the new data about antibiotic resistance? are there any practical clinical consequences of helicobacter pylori antibiotic resistance[j]. eur j gastroenterol hepatol, 1999, 11 (supp l2): s39-s42.
19de francesco v, margiottam, zullo a, et al. clarithromycin resistant genotypes and eradication of helicobacter pylori[j]. ann intern med, 2006, 144(2): 94-100.
20de francesco v, margiottam, zullo a, et al. primary clarithromycin resistance in italy assessed on helicobacter pylori dna sequences by taq man real time polymerase chain reaction[j]. aliment pharmacol ther, 2006, 23(3): 429-435.
21posteraro p, branca g,sanquinettim, et al. rap id detection of clarithromycin resistance in helicobacter pylori using a pcr based denaturing hplc assay[j]. j antimicrob chemother, 2006, 57 (1): 71-78.
22alarcn t, domingo d, prieto n, et al. pcr using 3'mismatched primers to detect a2142c mutation in 23s rrna conferring resistance to clarithromycin in helicobacter pylori clinical isolates[j]. j clin microbiol, 2000, 38(7): 923-925.
23elviss nc, lawson aj, owen rj. application of 3'mismatched reverse primer pcr compared with realtime pcr and pcrrflp for the rapid detection of 23s rdna mutations associated with clarithromycinresistance in helicobacter pylori[j]. int j antimicrob agents, 2004, 23(2): 349-355.
24posteraro p, branca g, sanguinetti m,et al. rapid detection of clarithromycin resistance in helicobacter pylori using a pcrbased denaturing hplc assay[j]. j antimicrob chemother, 2006, 57(1): 71-78.
25郭树彬, 刘军波, 陈琳洁, 等. 幽门螺杆菌基因分型及耐药检测寡核苷酸芯片的制备及鉴定[j]. 中国医学科学院学报, 2007, 29(1): 98-102.
26chattopadhyay s, patra r, ramamurthy t,et al. multiplex pcr assay for rapid detection and genotyping of helicobacter pylori directly from biopsy specimens[j]. j clin microbiol, 2004, 42(20): 2821-2824.
27fontana c, favaro m, pietroiusti a,et al. detection of clarithromycin resistant helicobacter pyloriin stool samples[j]. j clin microbiol, 2003, 41(30): 3636-3640.
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