大肠杆菌融合蛋白表达系统(在大肠杆菌中表达和纯化蛋白)

【摘要】 目的：用基因工程的方法克隆表达丙酮酸脱氢酶复合体e2（pdce2）融合蛋白，以用于人原发性胆汁性肝硬化（pbc）的早期发现和临床诊断。方法：针对pdce2的cdna序列设计引物，从正常人的淋巴细胞中提取rna，通过反转录pcr方法扩增得到相应的基因片段，经测定序列验证后插入表达载体pet28a(+)，构建重组表达载体pet28a(+)pdce2，转化大肠杆菌bl21(de3)后诱导表达蛋白质。表达蛋白经sdspage、western blot鉴定。结果：经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明，成功地构建了pdce2重组质粒。iptg诱导表达后，获得pdce2融合蛋白。经免疫学鉴定，重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型（amam2）的免疫原性。结论：获得pbc特异性靶抗原的多肽片段，为pbc的早期发现和临床诊断提供有力工具。

【关键词】 pbc 自身抗原 pdce2 重组融合蛋白

　　the cdna cloning and expression of autoantigen pdce2

　　zhou ye, yao dingkang, chen yan, jiang tianshu, jiang tingwang, wu chuanyong, chen bo, zhong renqian, deng anmei.

　　laboratory diagnostics, changzheng hospital,second military medical university,and clinical immunology center of pla, shanghai 200003, china

　　［abstract］ objective:to express pdce2 recombinant fusion protein in s:the cdna encoding pdce2 was obtained by rtpcr, confirmed by dna sequencing, subcloned indirectionally into the bacterial expression plasmid pet28a(+) and then transformed into . bl21(de3) to express the recombinant fusion protein induced by s:the recombinant fusion protein exhibited the antigenicity of amam2 by western sion:the pdce2 recombinant fusion protein could be used for diagnosing pbc.

　　［key words］ pbc；autoantigen；pdce2；recombinant fusion protein

　　原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，pbc）是一种以肝内中小胆管的非化脓性进行性炎性损伤为特征、最终导致肝硬化和肝衰竭的典型自身免疫性疾病（aid）［1，2］。患者体内可出现多种自身抗体，其中最主要的是抗线粒体抗体（ama）。ama分为m1～m9共9个亚型，而只有m2为pbc特异抗体。amam2抗体对pbc检测的敏感性达93%以上，特异性几乎达100%［3］。m2抗体的靶抗原为线粒体上的2氧酸脱氢酶复合体（2oadc）的一些组分：丙酮酸脱氢酶复合体e2（pdce2）、2氧酸脱氢酶复合体e2（bcoadce2）、2氧戊二酸脱氢酶复合体e2（ogdce2）等。其中pdce2是与m2反应的最主要靶抗原，pdce2的抗原表位主要位于内酯酰区和部分外酯酰区。我们用基因工程的方法表达pdce2融合蛋白，为pbc的早期发现和特异性诊断提供有效手段。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 血清标本 12例病人血清来源于本院住院病人，经德国euroimmun公司免疫印迹试剂盒测定，m2抗体为阳性；12例正常人血清来源于本院健康体检者。

　　1.1.2 主要试剂 反转录酶、pcr扩增试剂盒、rna提取试剂盒为qiagen公司产品；各种限制性内切酶、t4dna连接酶购自takara公司；pet28a(+)质粒及大肠杆菌bl21(de3)购自novagen公司；间接免疫荧光法测定ama试剂盒购自euroinmun公司。

　　1.1.3 引物 参照人pdce2全序列，设计了扩增pdce2内酯酰区和部分外酯酰区的引物。pdce2正向引物：5′ttcgccgtgcaaaaattatacactggtatcctg3′；pdce2反向引物：5′acagctgtgagctctaaatctgttacttcggttg3′。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因克隆操作 用淋巴细胞分离液从健康人外周血中分离单个核细胞，得到的白细胞抽提rna，反转录得到cdna。pet28a(+)质粒用node ⅰ和ecor ⅰ双酶切后、经t4dna连接酶的作用将pdce2的cdna定向插入其中，送上海生工生物工程技术公司测定序列进行鉴定。pcr扩增反应条件为94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环后再进行72℃延伸5分钟。

　　1.2.2 重组质粒的转化和鉴定 将重组质粒用氯化钙转化法导入宿主菌bl21(de3)，加入lb培养液37℃振荡培养45分钟后涂布于lb平板上（含终浓度100 μg/ml卡那霉素）培养过夜。抽提质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳观察重组质粒和node ⅰ、ecor ⅰ双酶切后的产物。

　　1.2.3 重组融合蛋白的收集和纯化 次日挑取转化平皿上的菌落，接种于含卡那霉素的lb培养液中，37℃摇床培养扩增至a600为0.4左右，加入终浓度为0.1 mg/ml的异丙基硫代βd半乳糖苷（iptg），诱导表达4小时，4℃离心收集菌液。将菌液反复冻融4次，经超声破碎仪以300 w 15秒，破碎4次，以上操作在冰浴中进行。而后在4℃、10 000 g离心15分钟，收集沉淀，以含0.5%tritonx100，10 mmol/l edta的缓冲液洗涤后，用100 μl裂解缓冲液（含0.1 mmol/l pmsf，8 mol/l尿素，10 mmol/l dtt）溶解包涵体，室温放置1小时。再加入900 μl氧化还原缓冲液，最后离心取上清。将上清液流经pbs平衡后的gst亲和层析柱，经20 ml pbs洗涤后，用5 mmol/l还原型谷胱苷肽溶液洗脱，收集洗脱液进行15%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺胶电泳（sdspage）分析。

　　1.2.4 重组蛋白抗原性的鉴定 重组蛋白经sdspage电泳后进行转印，200 ma 40 v 2小时。将转印后的nc膜剪成条带，用含5%bsa的pbs封闭1小时，分别与1∶1 000稀释的人m2阳性血清、正常人血清为一抗反应2小时，充分洗涤后与1∶1 000稀释的hrp标记的兔抗人igg二抗反应2小时，再次洗涤后加入3，3二氨联苯胺底物及双氧水反应显色。用此反应过的m2阳性血清与pdce2工程菌的超声全菌裂解液混匀，4℃过夜，间接免疫荧光法测定ama。

　　2 结果

　　2.1 pcr扩增结果 按上述条件扩增出442 bp的片段，经dna测序表明它是pdce2基因的精确拷贝。

　　2.2 表达质粒的构建及鉴定 通过反转录pcr从正常人外周血单个核细胞中扩增相应基因片段，克隆入表达载体pet28a(+)，构建重组表达载体pet28a(+)pdce2。重组载体用限制性内切酶node ⅰ和ecor ⅰ酶切鉴定，序列经测定完全正确，见图1。再将表达pdce2融合蛋白的重组体导入大肠杆菌bl21(de3)中。为便于重组蛋白的提纯，我们使用pet28a(+)载体，该载体表达蛋白在n端带6个组氨酸尾巴，用以使ni2+nta琼脂进一步纯化，组氨酸尾巴一般不影响重组蛋白的抗原性。

　　图1 重组质粒pet28a(+)/pdce2双酶切鉴定电泳图（略）

　　fig.1 recombinant plasmid pet28a(+)/pdce2 after enzyme digestion

　　note:lane pet28a(+);lane inant plasmid; marker dl2000.

　　图2 pdce2融合蛋白的12%sdspage电泳图（略）

　　fig.2 12%sdspage of pdce2 fusion protein

　　note:lane lysis of bl21(de3) containing vector pet28a(+);lane supernatant of the lysis of bl21(de3) containing recombinant plasmid;lane pellet of the lysis of bl21(de3) containing recombinant plasmid;lane ed pdce2 fusion protein;n marker.

　　图3 用western blot方法鉴定pdce2融合蛋白抗原性（略）

　　fig.3 identification of antigencity of pdce2 fusion protein by western blot

　　note:n marker;lane ed pdce2 fusion protein+antim2 positive serum;lane ed pdce2 fusion protein+normal serum control.

　　2.3 重组蛋白的诱导表达 重组质粒的工程菌经iptg诱导后进行12%sdspage电泳，在细菌裂解液（上清液）中及包涵体中可见有一条明显的额外蛋白带，相对分子量为18×103，见图2。

　　2.4 重组蛋白抗原性的鉴定 用western blot方法进行检测，12例m2阳性的病人血清中，抗pdce2抗体全部为阳性；12例正常人血清中，抗pdce2抗体全部为阴性，见图3。m2阳性的病人血清与表达pdce2全菌裂解液混匀过夜后，间接免疫荧光法测定ama为阴性。

　　3 讨论

　　据国外研究报道，pbc发病率约为2～24/10万，年发病率为0.4～3.0/10万，且该数值有逐年递长趋势［4］。近年来国内pbc发病率亦不断增加［5］。但尚不清楚这是pbc发病数真正增加还是对该病的认识加强、诊断增加所致。因此，对pbc的早期发现和临床诊断显得尤为重要。ama中只有m2抗体为pbc特异性抗体，其他亚型可见于很多疾病如药物损害、心肌病、类风湿性关节炎及一些感染如结核、梅毒等。间接免疫荧光法无法对ama分型，用于诊断pbc的特异性差。本实验检测的12例m2阳性的病人血清中，全部与pdce2融合蛋白反应。m2抗原在细胞内含量较少，传统生物化学方法提纯和制备抗原有很大的局限性，操作复杂，成本高，很难获得纯化的线粒体抗原，影响检测结果。而利用本方法可大量获得所需抗原，用于pbc的免疫学诊断，为pbc的早期发现和临床诊断提供有力工具。

【参考文献】
　　1 mackay i r,gershwin m e. the nature of autoimmune disease ［j］.semin liver dis,1997;17(1):311.

　　2 kaplan m m. primary biliary cirrhosis ［j］.new engl j med,1996;335(21):15701580.

　　3 persch w,becker h d. frequency and prognosis of gastric stump cancer ［j］. front gastrointest res,1979;5:170177.

　　4 metcalf j v,mitchison h c. natural history of early primary biliary cirrhosis ［j］. lancet,1996;348(9039):13991405.

　　5 姚光弼. 重视原发性胆汁性肝硬化的临床研究 ［j］.中华肝脏病杂志，2002;10（5）：

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