芯片瞬间等速电泳-筛分电泳偶联分析精确计算

中国论文网 发表于2022-11-05 11:57:52 归属于医疗卫生 本文已影响482 我要投稿 手机版

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【摘要】 建立了基于相对迁移时间比例的方法,依据待侧dna片段相对于上位及下位内标的迁移时间比例进行长度预测。实验结果显示,dna片段的相对迁移时间比例在不同分析条件下具有良好的重现性。通过建立相对迁移时间比例相对于dna片段长度的对应关系公式,实现了芯片瞬间等速电泳条件下dna片段长度的准确预测。实际样品分析证实这种基于相对迁移时间比例的计算方法简单可靠,适合于芯片titp-cge分析中dna长度的精确判定。

【关键词】 芯片电泳;瞬间等速电泳;dna长度计算;迁移时间;样品盐浓度

precise prediction of deoxyribonucleic acid sizes with transient isotachophoreis-capillary gel electrophoresis analysis on a microchipliu da-yu,liang guang-tie,mo jian-kun,zhou xiao-mian(laboratory of advanced clinical chemical technology,guangzhou first municipal people′s hospital,affiliated hospital of guangzhou medical college,guangzhou 510180)(department of laboratory medicine,guangdong no.2 provincial people′s hospital,guangzhou 510317)abstract the migration-time in transient isotachophoresis (titp) separation is affected by sample salinity as the dependence of itp time on sample-zone sample-to-sample variation of migration-time in microchip titp-cge analysis is an undesired factor for precise dna this work,a dna sizing method that based on relative migration-time proportion (rmp) was developed to eliminate the effect of sample salinity on sizing was defined as the ratio of the migration-time difference between the target fragment and the lower marker to that between the upper marker and the lower rmp values were tested to be reproducible in microchip titp-cge separations irrespective of sample of a target dna was predicted by fitting its rmp value to the equation derived from rmps of standard dna ladder precision and reproducibility of the sizing method were validated testing multiple standard pcr mental results showed that the rmp method is simple and reliable,thus well suited to precise dna sizing with microchip titp-cge analysis.

  keywords microchip electrophoresis;transient isotachophoresis;deoxyribonucleic acid sizing;migration time;sample salinity

  1 引言

  芯片电泳具有快速高效分析、低消耗和便于实现各种操作单元灵活组合及规模集成的特点[1,2]。上述特点和优势使得芯片电泳成为一种极具发展潜力的生物分析技术。dna分析是芯片电泳最为成功的应用领域之一,多种类型dna样品在芯片平台实现了高效分析[3~5]。芯片电泳由于采用微尺寸通道便于实现高效分离,但同时由于通道尺寸造成的进样量限制也影响了检测灵敏度。为改善芯片电泳检测灵敏度,近期研究发展了多种在线预浓缩方法并取得显著效果[6]。等速电泳是在芯片dna分析中应用较为普遍的在线预浓缩技术[7~9],该技术可显著改善检测灵敏度而不损失分离效率。瞬间等速电泳(transient isotachophoresis,titp)是一种简化的等速电泳预浓缩方式,利用样品基质(sample matrix)中的离子为前导或尾随离子,将等速电泳预浓缩与后续的区带电泳分离偶联[10]。在芯片上偶联瞬间等速电泳和筛分电泳(titp-cge),可以简单有效地改善高盐dna样品的检测灵敏度[11,12]。

  dna定性分析通常是通过比较待测样品与标准样品的迁移时间来确定dna片段大小,因而不同样品迁移时间的一致性对于长度判定的精确性具有重要影响。在titp-cge分析中,由于等速电泳持续时间受样品区带电导率影响,样品盐浓度影响瞬间等速电泳持续时间以及整体迁移时间[13,14]。不同盐分样品之间的迁移时间差异不利于精确定性分析。针对这个问题,曾有研究报道通过引入内标校正titp分析中由于样品盐分不同引起的迁移时间变异[14]。本研究中,为了消除样品盐浓度对于dna长度判定的影响,在芯片titp-cge dna分析中引入内标。待侧dna片段相对于双内标的迁移时间比例,即相对迁移时间比例(relative migration-time proportion,rmp),用于dna长度计算。研究结果显示,本方法(以下简称rmp法)简单可靠,适合于芯片titp-cge分析中dna长度的精确判定。

  2 实验部分

  2.1 仪器与试剂

  芯片电泳实验在自行研制的激光诱导荧光微流控芯片电泳分析仪[11]上完成。该仪器由芯片电泳平台、光学检测系统、ccd监测、高压电源控制和操作软件组成,检测方式为共聚焦激光诱导荧光。仪器分析软件可以设定电泳分析各步骤中电极输出状态,显示电泳谱图以及迁移时间、峰高、峰面积和半峰宽等参数。咪唑、n-(乙-羟乙基)哌嗪-n-2乙烷磺酸(hepes,sigma公司);羟丙甲基纤维素(hpmc,2%,粘度为40~60 cp,aldrich公司);系列标准dna片段,100 bp dna ladder (100~600 bp, tiangen公司); 50 bp dna ladder(50~1500 bp, takara公司);插入式dna标记染料genefindertm (biovision公司)。

  2.2 实验方法

  2.2.1 芯片设计和制作 玻璃基板(6.5 cm×6.5 cm,长沙韶光铬版有限公司)表面涂有正光刻胶。玻璃芯片采用标准光刻-湿法腐蚀-热封接方法加工而成[15]。芯片通道为双t结构,有效样品区带长度7.5 mm。芯片通道深度30 μm,通道半高宽50 μm。芯片电泳有效分离通道长度为4 cm,参考文献[16]的方法对通道表面进行线性丙烯酰铵涂层以抑制电渗流和表面吸附。

  2.2.2 芯片电泳 芯片电泳实验中使用运行缓冲液含20 mmol/l hepes-40 mmol/l咪唑、1 × genefinder以及不同浓度的hpmc筛分介质;缓冲液ph=7.5。缓冲液使用双蒸水配制,使用前过滤。

  芯片在titp-cge分析中,缓冲液b首先加在bw,然后是b和sw(图1)。在s储液池使用真空泵连续施加负压,所有通道充满筛分介质。

  图1 芯片电泳titp-cge分析示意图(略)

  fig.1 illustration of transient isotachophoresis(titp-cge) analysis on a microchip with the double-t sample injector unit

  含前导电介质样品(sample in ie);前导离子(leading ions);含背景电介质筛分介质(bge in sieving matrix); s.样品(sample);sw.样品废液(sample waste);b.缓冲液(buffer);bw.缓冲液废液(buffer waste)。最后,样品加于s储液池。电分析程序包括两步:进样过程在s和sw之间施加300 v/cm场强,s接地,持续30 s;分离过程在b和bw之间施加分离场强,b接地,持续300 s。

  3 结果与讨论

  3.1 titp-cge偶联芯片电泳分离机制

  dna样品通常含有较高盐分,电进样时由于样品盐浓度对于进样量的影响[17],进样量受到抑制因而影响检测灵敏度。titp-cge分析可以通过进样量的增加提高信号强度,适合于改善芯片电泳分析的检测灵敏度。本实验中的titp预浓缩选择 hepes为尾随离子,cl-为前导离子,dna的迁移速度介于hepes和cl-之间。dna样品通常含有较高cl-浓度,可直接用作前导离子而不必额外使用前导缓冲液。

  如图1所示,titp-cge分析都包含进样、titp预浓缩与cge分离3个过程。与十字架结构芯片通道相比,本实验使用的双t结构进样通道允许更大的进样量。施加分离电压后,cl-由于迁移速度快而迅速形成前导区带,这样cl-, dna和hepes 依据迁移速率形成连续区带,电导率从前导区带到尾随区带依次降低。由于电导率的差异,位于前导区带后的样品区带分担较高场强。因此,dna样品区带被压缩成狭窄样品塞。由于不同长度dna片段在筛分介质中迁移速度不同,每个片段的titp预浓缩是依次完成的。随着分离时间的延长,前导离子浓度因扩散而逐渐降低。当前导离子浓度降低到一定程度,itp状态不能够继续维系而转为cge。由于样品区带各个组分在titp过程被压缩为狭窄样品塞,后续cge的分离度不会因为进样量增加而损失。因此,titp和cge偶联分离方式可以简便有效地改善检测灵敏度。使用这种芯片titp-cge分析方法,dna预浓缩/分离操作得以简化,整个分析过程仅需1种运行缓冲液和4个电极就可以完成。

  3.2 样品盐浓度对titp-cge分离迁移时间的影响

  dna的titp预浓缩效果受样品中盐浓度影响。一方面,根据kohlrausch调节公式(kohlrausch regulating function,krf)[18],等速电泳压缩区带中样品浓度取决于前导离子浓度;另一方面,titp预浓缩效果还受等速电泳持续时间影响,而后者与样品盐浓度有关[13]。

  在titp和cge偶联分离中,cge在titp结束后开始。若某一样品组分的迁移时间为tm,则有

  tm=ttitp+tcge(1)

  其中,ttitp和tcge分别是该样品组分的等速电泳持续时间和筛分电泳从启动至到达检测点的时间。由于titp为样品区带压缩过程,基本没有分离。titp的持续时间影响cge启动时间以及样品各个组分的迁移时间。在样品基质中含有前导离子条件下,样品i的ttitp维持时间计算公式[13]为

  ttitp=ls·κs i·(μl-μτ) (μl-μi)2(2)

  其中,ls和κs分别为样品区带长度和其电导率,i是电流,μl, μi和μt分别为前导离子、样品和尾随离子的迁移速率,μl>μi>μt。根据公式(2)可知,在给定条件下(包括分析样品、背景缓冲液成分、分离场强和样品区带长度),titp维持时间与样品区带电导率成正比。电导率κs的计算公式为

  κs=f·∑ciziui(3)

  其中f是法拉第常数,ci是某种离子浓度,zi是离子的电荷数,ui是离子迁移率。从公式(2)和式(3)可知,瞬间等速电泳维持时间与样品的盐浓度有关。高盐样品因为电导率高,titp维持时间较长并相应地导致cge启动延迟,反之亦然。不同类型dna样品盐浓度差异很大,会影响电泳迁移时间的一致性而导致dna长度判定偏差。如图2所示,dna ladder的样品基质为te缓冲液(10 mmol/l tris-hcl,1 mmol/l edta),其盐浓度与pcr样品缓冲液(10 mmol/l tris-hcl,50 mmol/l kcl,2.5 mmol/l mgcl2)具有较大差别。从分析结果可见,由于样品盐浓度的差异,titp-cge分析中pcr产物和具有相同片段长度的dna marker迁移时间存在明显差异,样品盐分不同导致的迁移时间变化不利于精确判定dna长度。

  图2 芯片titp-cge方法分析pcr产物(200 bp)和dna ladder(100~600 bp)的电泳谱图(略)

  fig.2 microchip titp-cge analysis of 200 bp pcr product and 100-600 bp dna ladder

  te buffer:10 mmol/l tris-hcl,1 mmol/l edta; pcr buffer : 10 mmol/l tris-hcl,ph 8.3,50 mmol/l kcl,2.5 mmol/l mgcl2.

  3.3 基于rmp的dna长度计算方法

  rmp法的原理是通过引入相对迁移时间比例这个参数来克服titp-cge分析中存在的迁移时间不重复问题。样品中盐分的差异可以影响迁移时间但不会影响dna片段之间的相对迁移速度,因为dna在一定浓度筛分介质中的相对迁移速度只与片段长度相关。图3描述了rmp法计算dna长度的原理。rmp法需要引入上位内标和下位内标,其中下位内标迁移时间低于待分析样品中所有组分, 而上位内标迁移时间高于样品中所有组分。如果上位内标与下位内标迁移时间差为δt,而某一待测dna片段与下位内标的迁移时间差为δt,则其相对迁移时间比例rmp =δt/δt。依据这种计算方法,样品中dna片段的rmp值在0~1分布之间。通过分析dna ladder,获取一系列标准长度dna片段的rmp值。利用拟合方程建立rmp值与dna片段长度的对应关系式, 待测dna样品同样加入上位内标与下位内标,以获得每个待侧dna片段的rmp值。将待侧dna片段的rmp值带入公式,即可计算出其片段长度。

  图3 图示说明基于相对迁移时间比例的dna长度计算方法(略)

  fig.3 illustration of relative migration-time proportion(rmp) sizing approach

  从表1和图3b可见,含不同盐分的样品中dna的rmp值与片段长度都具有良好的相关性。结果显示,在上位内标与下位内标片段长度差较小条件下具有更好的相关性。在16~600 bp测量范围内,经过三级对数衰减模型拟合(exponential decay model,third order),rmp值与dna片段长度的相关性可以达到0.999以上;在50~1500 bp范围内,其相关性也达到0.99以上。考察发现,虽然不同dna样品迁移时间差别较大,但其rmp值的重复性相当好。上述结果提示,rmp法可以精确判定dna长度。

  表1 芯片titp-cge分析中dna片段rmp值重复性以及其与dna长度相关性的考察(略)

  table 1 reproducibility of rmp and its correlation with dna size by titp-cge on a microchip

  *a :2%hydroxyproly-methyl cellulose(hpmc); *b : 1.5% hpmc;*c :0.8% buffer:10 mmol/l tris-hcl, 1 mmol/l edta; pcr buffer: 10 mmol/l tris-hcl,50 mmol/l kcl,2.5 mmol/l mgcl2。

  考察了不同titp-cge分析条件,包括分离场强、筛分介质浓度以及样品盐浓度对于dna长度判定的影响(表2)。结果显示,较低分离场强不利于提高dna长度判定精度。考虑是因为低场强条件下不利于提高titp预浓缩效率,造成titp持续时间延长以及cge分析中峰拓展等因素影响迁移时间判定。根据实验结果, 选择190 v/cm分离场强用于后续分析。由于电进样条件下样品盐分对于进样量的影响,不同盐分dna样品的信号强度存在明显差别(图4),但是根据rmp值相应长度dna片段都能够对齐。此结果说明,通过rmp校正可以消除样品的盐浓度对于迁移时间的影响。在所使用0.8%~2% hpmc筛分介质浓度条件下,都可以获得满意的定性精度。因dna片段在不同浓度筛分介质中的迁移行为存在差别,其在不同筛分介质中的rmp值也存在差别。因此,针对某种筛分缓冲液要建立针对性dna片段长度计算公式。上述结果显示,rmp法适用于较宽的实验条件范围,此方法可以有效解决样品盐浓度变化对于dna长度判定的影响。

  表2 不同分析条件下rmp法dna长度计算精度的考察(略)

  table 2 average error(%) of predicted sizes under different separation conditions

  表中数值为10次平行分析的平均值(the figures are average values from 10 parallel separations)。a.0.5×pcr buffer 0.8% hpmc;b.190 v/cm field strength 0.8%;c.190 v/cm field strength 0.5×pcr buffer.d.下位内标(lower-marker) 50 bp,上位内标(upper-marker):1500 bp; e.下位内标(lower-marker):16 bp,上位内标(upper-marker):800 bp; f.下位内标(lower-marker):16 bp,上位内标(upper-marker):600 bp。

  图4 不同盐分dna样品的芯片titp-cge分析结果(a)及使用rmp法处理后的电泳谱图(b)(略)

  fig.4 waterfall mode electropherogram showing dna samples of different salinity that analyzed with microchip titp-cge (a),and the electropherograms aligned by rmp (b)

  下位内标(lower-marker)16 bp;上位内标(upper-marker): 1500 bp。 系列dna片段碱基对数目(the sizes of dna fragment):50,100,150,200,250,300,350,400,450,500,600,700,800,900 and 1000 bp。

  3.4 实际样品分析考察rmp方法

  分别使用16~600 bp以及50~1500 bp内标对一系列标准pcr产物进行了长度计算,以考察rmp法长度计算精度。从图5可见,根据rmp值,每个pcr产物与dna ladder中相同长度dna片段都能够对齐。将pcr产物rmp值带入计算公式,计算结果显示,16~600 bp范围内计算偏差为1.32%,
而50~1500 bp范围内计算偏差为1.04%(表3)。由于分辨力的限制以及碱基构成和二级结构对双链dna迁移速率的影响[19,20],双链dna的定性精度低于单链dna。本实验所获得的dna定性精度达到了标准芯片无胶筛分电泳的水平[21]。 上述结果证明, rmp法能够有效消除因为迁移时间不重复对于dna长度判定精度的影响,适合于titp-cge条件下芯片电泳dna片段长度的精确判定。

  图5 根据rmp值将系列标准pcr产物分析结果与dna ladder对齐(略)

  fig.5 electropherograms aligned by ical data was from microchip titp-cge analysis of standard pcr products

  下位内标(lower-marker):16 bp,上位内标(upper-marker):600 bp。dna ladder样品基质为(te buffer): 10 mmol/l tris-hcl,1 mmol/l edta;pcr buffer:10 mmol/l tris-hcl,ph 8.3,50 mmol/l kcl,2.5 mmol/l,mgcl2。图中标示数字为dna片段碱基对数目(the numbers on electropherograms correspond to the sizes of pcr product in bp)。

  表3 rmp法对标准长度pcr产物的长度计算结果(略)

  table 3 predicted sizes of standard pcr amplicons with rmp method

  a.分离条件(separation conditions):1.5 % hpmc,190 v/cm;下位内标(lower-marker)16 bp,上位内标(upper-marker)600 bp;b.分离条件(separation conditions): 0.8% hpmc,190 v/cm; 下位内标(lower-marker)50 bp,上位内标(upper-marker)1500 bp。

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