热休克蛋白在细胞内发挥作用(诱导细胞产生热休克蛋白的应激原有)

【摘要】 目的：探讨动脉粥样硬化中重要炎性物质——热休克蛋白60(hsp60)体外对小鼠树突状细胞(mdc)功能影响。方法：小鼠骨髓提取dc，体外培养成熟后与两种浓度mhsp60孵育，动态观察dc突起改变；流式细胞仪检测孵育前后mdc表面标志改变；mlr测定孵育前后mdc刺激功能变化；elisa法测定mlr上清液中细胞因子浓度。结果：孵育后，mdc突起增加明显；cd11c+、cd80及cd86表型显著增加；淋巴细胞刺激功能明显增强；分泌细胞因子il12、ifnγ增加（p<0.01）而il4增加不明显(p>0.05)，ifnγ/il4比值升高。结论：mhsp60体外可以促进mdc功能，作用呈剂量依赖性。

【关键词】 热休克蛋白60 树突状细胞 动脉粥样硬化 表型 细胞因子

　　effect of heat shock protein 60 on murine dendritic cell function in vitro

　　wu wei, li dazhu, zhou you, zeng qiutang.

　　department of cardiology, union hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430022, china

　　［abstract］ objective:to investigate the effect of heat shock protein 60(hsp60), significant inflammatory factor in atherosclerosis, on the maturation of murine dendritic cells(mdcs) in s:myeloid mdcs were extracted in vitro from mouse marrow and incubated to mature with two distinct concentrations of morphological changes were observed;the variation of phenotype was detected with flow cytometric analysis; the stimulating capacity was determined in allogenic mixed lymphocyte reaction(mlr); elisa was used to analyze the level of cytokines secreted by mdcs and stimulated lymphocyte in the medium of s:dendrites of mhsp60dcs raised obviously. the expression of costimulating factor cd11c+, cd86, cd80 was upregulated. the stimulating capacity of mhspdcs in mlr was higher. t lymphocytes cocultured with mhspdcs in mlr secreted higher levels of proinflammation cytokines(ifnγ, il12) but there were no significant difference of il4, the stimulatory action was dose dependent and was evident at higher concentrations. the ratio of ifnγ/il4 was sion:mhsp60 progressed the maturation of mdc dosedependently in vitro.

　　［key words］ heat shock protein 60；dendritic cells；atherosclerosis；phenotype；cytokines

　　研究表明，动脉粥样硬化（atherosclerosis, as）的发生和发展与炎症免疫反应密切相关。树突状细胞（dendritic cells ,dc）作为最强的专职抗原提呈细胞能有效刺激初始t细胞对异体及自身抗原产生免疫应答，维持免疫平衡［1］。许多证据证明dc聚集在粥样斑块的局部，冠心病者循环亦存在dc激活的证据，提示dc在动脉粥样硬化的炎性反应中起重要作用。动脉粥样硬化时dc的激活抗原尚不清楚［2］。已知动脉粥样硬化斑块中存在热休克蛋白(heat shock protein, hsp)60，冠心病者循环中存在抗hsp60抗体，故认为hsp60是动脉粥样硬化的相关抗原之一［3］。hsp60对dc的作用国内尚无报道，本文探讨其对小鼠dc成熟和免疫功能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及主要试剂 10周龄雄性c57bl/6j鼠购自北京维通利华实验动物有限公司；rmgmcsf和rmil4购自biosource公司；fitcanti mouse cd11c+、peanti mouse cd80及peanti mouse cd86购自biolegend公司；mhsp60购自stressgen公司；il4、ifnγ、il12 elisa试剂盒购自r&d公司。完全培养基包括：rpmi1640(gibco公司)，20%胎牛血清(gibco公司)，青霉素100 u/ml，链霉素100 u/ml，20 ng/ml rmgmcsf，20 ng/ml rmil4。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠骨髓dc培养 参照文献［4］方法稍做改进。简言之，取小鼠股骨和胫骨，去掉骨两端，用5 ml注射器吸取rpmi1640液冲洗髓腔，收集所得液体，200目尼龙网过滤后，trisnh4cl溶解红细胞，细胞悬于20%胎牛血清rpmi1640培养液中，种植于50 ml培养瓶中，置于37℃、5%co2孵育箱中，过夜后，弃去悬浮细胞，再加3 ml新鲜完全培养基，37℃、5%co2温箱培养，隔天半量换液，每次换液均保留细胞悬液直至第9天。

　　1.2.2 实验分组及细胞处理 将培养第9天的细胞分为3组：①对照组：培养液加pbs；②高剂量组：培养液加mhsp60 10 μg/ml；③低剂量组：培养液加mhsp60 3 μg/ml。3组均孵育24小时后保留细胞悬液。

　　1.2.3 形态观察 培养3、5、9和10天，用倒置显微镜，电镜和fitcanti cd11c+荧光染色后在荧光显微镜下观察dc形态。

　　1.2.4 流式细胞仪检测（fasc） 收集细胞调整密度为1×106 ml-1，每管为100 μl，加入标记抗体fitccd11c+、pecd80及pecd86，各0.1 μg，4℃孵育20分钟，pbs洗2遍，加入0.5 ml pbs重悬，美国becton dickinson公司流式细胞仪双标检测mdc的表型，以cd11c+设门，cellquest软件分析。

　　1.2.5 同种混合淋巴反应（mlr） 取近交系balb/c小鼠脾脏匀浆过滤后，去除红细胞培养2～3小时后取悬浮细胞，即淋巴细胞作为反应细胞。调整淋巴细胞为105/孔，mdc为104/孔，在96孔培养板中37℃、5%co2孵育96小时，取上清液保存，-70℃测细胞因子；再于每孔中加入mtt 20 μl，混匀后，37℃、5%co2孵育4小时，加dmso溶解后，560 nm波长检测a值。

　　1.2.6 细胞因子的检测 按照elisa试剂盒说明检测细胞培养液及mlr的上清液中il4、ifnγ和il12水平。以加pbs的细胞悬液为对照组，mhsp60孵育后的细胞悬液为处理组，并按浓度不同分为2组。

　　1.2.7 统计分析 使用spss 10.5统计软件统计分析。数据用x±s表示，组间比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 dc形态观察

　　2.1.1 倒置显微镜下观察 培养第3天可见细胞成簇生长，由圆形变为不规则形，并长出一些小刺状结构，细胞质变得丰富；培养第5天，树突样结构更加明显，胞质更加丰富；培养第9天，细胞数目增加显著，开始有部分悬浮或半贴壁；孵育后，即第10天，细胞大部分悬浮或半贴壁，少数贴壁，见图1。

　　2.1.2 荧光显微镜观察 处理组可见细胞成簇生长，细胞形态不规则，周边成毛刺状，低剂量与高剂量无明显差别；未处理组细胞成簇生长，细胞形态椭圆形，细胞核似蚕豆状，毛刺状不明显，见图2。

　　2.1.3 电镜观察 处理组细胞核呈分叶状，内吞区域多，细胞表面突起明显；未处理组细胞核圆，内吞区域少，细胞表面突起较处理组为少，见图3。

　　图1 倒置显微镜下观察细胞形态变化(×10)（略）

　　fig.1 morphologic change of mdcs by inverted microscope(×10)

　　note:mdcs on day 10 of culture(incubated with mhsp60).

　　图2 荧光显微镜观察(×40)（略）

　　fig.2 mdcs observed by fluorescence microscope(×40)

　　note:mdcs(incubated with mhsp60) stained by fluorchrome fitccd11c+.

　　图3 电镜观察(×4 000)（略）

　　fig.3 mdcs observed by electron microscope(×4 000)

　　note:mdcs(incubated with mhsp60) stained by transmission electron microscope.

　　图4 热休克蛋白对树突状细胞成熟表型的影响（略）

　　fig.4 hsp effect on phenotype of mdcs maturation

　　note:graph a and b display cd86 and cd80 expression of mdcs, respectively. graph a shows cd86 positive, 43.1% in control group, 59.7% in lowdose group and 87.2% in highdose group. graph b shows cd80 positive, 48.6% in pbs group, 63.2% in lowdose group and 76.7% in highdose group.

　　表1 elisa法检测细胞因子浓度（略）

　　tab.1 detection of cytokines concentration by elisa

　　note:mhsp60 group compared with control group,1) p＜0.01；lowdose group compared with highdose group,2) p＜0.01.

　　2.2 细胞表型检测 收集不同浓度mhsp60孵育的mdc及未加mhsp60的mdc，用流式细胞仪分析其表型cd11c+、cd80及cd86，结果显示：与对照组相比，处理组的cd80及cd86表达显著增高（p<0.01）。处理组内随mhsp60的浓度增加，cd80及cd86表达越明显，见图4。

　　2.3 同种混合淋巴反应 调节dc密度为5×104 ml-1时，dc刺激t淋巴细胞增殖的a值，高剂量组为6.3±2.9，低剂量组为3.8±1.6，显著高于对照组1.7±0.5(p<0.001)，说明hsp60dc刺激t淋巴细胞的能力明显增强；而高剂量组hsp60dc比低剂量组刺激能力更强(p<0.001)，说明hsp60dc刺激能力与mhsp60剂量呈正相关。

　　2.4 细胞因子检测 各悬液的细胞因子浓度见表1。处理组与对照组il4没有明显差别(p>0.05)；处理组的il12与ifnγ显著高于对照组（p<0.01），而高剂量组又较低剂量组浓度高（p<0.01）。il4/ifnγ比值处理组明显高于对照组(p<0.01)，而处理组内仍有差别（p<0.01），提示mhsp60使mdc刺激的免疫类型以细胞免疫为主，即产生免疫偏移。

　　3 讨论

　　动脉粥样硬化明确的病理过程尚不清楚，但目前认为其起始、发展与免疫炎症密切相关。树突状细胞作为体内最强的抗原提呈细胞，是免疫反应起始及发展的关键。初始t淋巴细胞必须与之接触后，通过mhc抗原的识别和cd80(b71)、cd86(b72)等共刺激分子的配对及某些细胞因子的作用才能激活，发挥生物学效应。我们以往证实动脉粥样硬化病人循环中dc的功能是增强的，且在体外应用不稳定型心绞痛一线药物阿托伐他汀后，dc的功能明显抑制［5，6］；而bobryshev等［7］亦发现了动脉粥样硬化斑块中存在dc及dc与t细胞接触的证据，肯定了dc参与动脉粥样硬化的发生及发展过程。

　　在动脉粥样硬化病理过程中dc所提呈的抗原目前认为有多种，如人巨细胞病毒、肺炎衣原体、oxldl（氧化型低密度脂蛋白）、hsp60等。而hsp60日益被重视，hsp60被认为是dc提呈的关键抗原之一。hsp是一类进化上高度保守的分子，细菌与人的hsp存在高度同源性。因而某些细菌感染后，dc细胞提呈细菌hsp65于t淋巴细胞所产生的抗体与人hsp60可能存在交叉反应，近年来这已在多种自身免疫疾病研究中得到证实［8］。同时研究表明病人血浆hsp60抗体滴度水平与冠心病发生存在相关性，血清抗分枝杆菌hsp65抗体在冠状动脉粥样硬化、血管炎、心肌缺血以及ptca术后狭窄患者中明显升高，且抗体水平升高可提示严重动脉粥样硬化的预后［3］。最近已有报道急性冠状动脉综合征病人的体内存在hsp60特异性t细胞，因而认为由于dc在细菌hsp65和人的hsp60之间存在交叉识别，某些细菌感染后dc摄取处理hsp65后呈递于初始t淋巴细胞，使之激活，而致敏t细胞通过交叉识别可能对自身血管内皮细胞产生免疫损伤，引起炎症反应，在动脉粥样硬化病人中则会引起粥样斑块增生和不稳定［9］。但是目前hsp60对dc的功能影响尚无报道，本研究在体外探讨了hsp60对dc的功能影响。

　　本研究中证实了hsp60在体外可以显著地提高dc免疫功能，表现在hsp60孵育后的dc共刺激分子cd86、cd80表达增加，抗原呈递功能增强，促使t淋巴细胞增殖及分泌细胞因子il12、ifnγ能力提高。值得注意的是，dc免疫功能的提高是hsp60剂量依赖性的。由于免疫过度激活是动脉粥样硬化启动因素，因而在斑块局部抑制hsp60/65激活dc，减少免疫炎性损伤，可能会起到抑制斑块增生和稳定斑块的作用，为预防或治疗动脉粥样硬化相关疾病提供新的思路。

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