【摘要】 目的:以doucet介绍的方法为基础,改良了测定大鼠肾脏近端小管na+k+atpase活性的方法。方法:首先,利用自制的玻璃分针能准确而迅速的分离获取近端小管;其次,使用传导性能较好和易于折叠的锡箔纸代替了铝片,简化了孵育和测定过程。结果:改良方法与doucet建立的经典方法比较,测定结果无显著性差异(p>0.05);但对小管长度确定平均耗时和转移含32p的孵育液平均耗时明显降低。结论:本文介绍的测定大鼠肾脏近端小管na+k+atpase活性的改良方法,减少操作步骤,缩短了操作时间和暴露在放射性环境中的时间;简化并改进了操作条件,降低了实验要求和成本。
【关键词】 近球小管; 钠泵; 活性测定; 改良方法; 大鼠
肾小管基底膜上的钠泵,是肾脏实现其功能作用的关键酶,测定该酶的活性,对不同状况下肾脏的功能研究具有重要的意义。测定单根肾小管钠泵活性的方法,doucet首先于1979年进行了较为详细的报道[1](简称doucet法),该方法目前仍是测定肾小管钠泵活性的最精确最常用的方法,特别是测定不同节段肾小管的钠泵活性[2]。过去的二十多年,doucet法得到了一些改进[3,4],但是改进并不显著。doucet法的技术要求高,准备与操作过程都比较复杂耗时,与32p接触时间较长,而该物质放射性相对较强,国内大多数实验室都不便开展,造成此项研究工作在国内的几近空白。改良doucet法(简称改良法),即在不影响测定结果的情况下,简化操作条件及步骤,降低物耗和时耗,使它适用于国内一般实验室,就显得十分必要和迫切。
1 材料
1.1 实验动物雄性wistar大鼠,体重200g,购自南方医大学动物实验中心。
1.2 主要试剂及器材hepes、na2atp、哇巴因和ⅱ型胶原酶(sigma)。[γ32p]atp(北京福瑞特公司)。xtj5400体视显微镜(广西梧州光学仪器厂),配套显像系统购自日本unican公司。sn6930a型液体闪烁计数器(上海核所日环公司)。基础分离液、液闪液及钠泵活性测定液的配制参照doucet1990年报告的方法[2]。
2实验方法
选取10只大鼠,平均分为2组,分别用于doucet法和改良法测定小管的钠泵活性,改良法实验方法如下:
2.1 单根肾近球小管的分离实验大鼠用1%戊巴比妥钠(40mg·kg-1,ip)麻醉后,右侧位固定于鼠板上。再沿脊柱左侧剪开皮肤,暴露肾脏,分离腹主动脉,结扎除左肾动脉以外的分支,经腹主动脉插管灌注左肾,先用1ml 1%肝素钠溶液,接着用1ml 0~4℃含0.2%胶原酶的分离液灌注。灌注后迅速切下左肾,除去肾包膜和肾蒂结构,置于洁净玻片上(玻片下放置低温冰袋)。用剃须刀片,将肾皮质沿皮质髓质轴切成0.5~1.0mm厚的薄片。将大约10片肾组织放入一容积为2ml的离心管中,管内预先装有1ml含0.15%胶原酶的分离液并预热至37℃,恒温水浴槽中孵育15~20min,持续充入95%的o2和5% co2的混合气体。孵育完毕用2ml含0.05 %牛血清白蛋白的分离液漂洗3~4次,0~4℃保存并于30min内完成分离。吸取0.1ml含肾小管组织的分离液到细菌学载玻片的中央凹处,在体视镜载物台上放置一个直径为90mm培养皿,内装洁净冰水和碎冰块,在培养皿内放置一个合适铝架,载玻片平放在铝架上,使玻片底部刚好与冰水接触(提供0~4℃的分离环境),用微分离针分离小管。辨认近球小管是根据它与肾小球、肾小囊、入球小动脉和其它肾小管节段的解剖关系和形态学特点决定的。转移前的小管直接摄像并保存图片,根据放大倍率确定小管长度。
2.2单根肾近球小管钠泵活性测定将0.5×0.5cm大小的锡箔纸15片紧贴在铝合金属盘内,纸片中央滴加5μl分离液,10根分离的单根小管分别转移到其中10片纸片上的分离液中,5片不含小管的作空白对照。分别用5μl蒸馏水代替小管周围等渗液,用保鲜膜密封金属盘,4℃,15min后,重新用5μl蒸馏水替换。随后,将密封金属盘直接与-80℃的超低温冰袋接触使其快速冰冻,然后将金属盘放置在0~4℃的冰箱内,待其逐渐融化后,含小管的10张锡箔纸片随机分成两组,分别滴加1μl测定总atp酶或mg2+atp酶活性的孵育液。将金属盘密封后放入37℃水育箱,孵育15min后将金属盘移到碎冰上,分别加入5μl 5%冷三氯醋酸终止反应。分别将锡箔纸连同反应液转移到含有2ml 10%活性炭悬液的试管中,混匀后离心沉淀(2500rpm,10min),取上清500μl直接放入含5ml液闪液的计数瓶,将液闪瓶放入液体闪烁计数器中,静止3小时,测定各样本cpm值。采用doucet建立的公式计算,钠泵活性用单位长度小管单位时间水解atp释放无机磷的数量来表示(pmol·mm-1·h-1),即以酶促反应速度表示酶的活性。
3 结果
3.1 微分离小管的结果图片见图1,a表示转移后的单根肾近球小管节段;b表示微分离的近球小管电镜图象。电镜下可见近球小管管腔面排列有长而密集的微绒毛(箭头所示),它是近球小管独特的超微结构。其次可见侧突发达,质膜内褶较深,可达细胞的游离面,胞吞小泡多,溶酶体发达,长杆线粒体十分丰富,与质膜内褶平行排列。
3.2 两种方法钠泵活性测定结果与部分操作耗时比较结果见表1,运用改良法测定钠泵活性结果无显著差异,但对小管长度确定平均耗时和转移含32p的孵育液平均耗时明显降低。表1 两种方法测定结果与部分操作耗时比较注:*与doucet法比p<0.05
4讨论
测定肾小管钠泵的活性,doucet法仍是目前最常用的方法。本实验技术是在doucet法的基础上,进行了较大的改进和完善,使实验条件和实验本身变得相对简单易行,可操作性大为提高,而且对测定结果并无明显影响。
本实验方法的改进主要体现在以下十个方面:①固定方法:与以往仰位固定比较,右侧卧位固定,沿脊柱左侧手术,左肾动脉及腹主动脉暴露充分,手术过程快,对其它脏器的影响小。②灌注:选择从腹主动脉途径插管灌注,比直接在左肾动脉插管要安全快捷;先使用抗凝剂肝素冲洗,能够清除肾脏内血液成分,减少胶原酶的用量以及方便后面的漂洗和分离。③灌注液和灌注速度:使用高浓度低用量的灌注液,降低灌注速度(0.5ml·min-1),可以提高胶原酶的利用率,缩短孵育时间,提高孵育效果。④通气装置:本实验用一简易装置完成,即在医用氧气袋的橡皮管上连接一个三通管,在其中一个通道上接上一根聚乙烯小管,即可方便控制通气。⑤微分离针:分离针是利用玻璃毛细吸管,在酒精喷灯上拉制而成,因为这种方法制备的微分针前端带有小弯钩,比用玻璃微电极拉制器拉制的微分针更加方便实用。⑥分离环境:环境温度稍高,载玻片上小管周围液体稳态环境极易改变,严重影响小管生物活性,但是,在一般实验室,提供一个0~4℃的工作环境是比较困难或造价高昂。本实验设计了一个简易的低温操作环境,效果好,几乎无需成本。⑦小管长度的确定:将小管转移到另一载玻片上,使用倒置显微镜拍照,确定小管长度,然后再将小管转移到发生酶促反应的铝片上。这样操作难度大,小管暴露时间长,酶的活性容易受到影响。如果在体视镜上装上显像系统,就可以在小管分离后,转移前进行直接拍照。这样,既简化了操作步骤,又能最大程度保证小管及酶的活性。⑧冻融材料:以往使用的干冰,在很多地方不易购买,保存时间又短。用存放在-80℃的超低温冰袋代替干冰,成本极低,操作方便。⑨酶促反应载体:将以往的带凹固定铝槽,换成超薄锡薄纸片,紧贴在金属盘内,反应终止后,直接将锡薄纸片转移到活性碳悬液中,快速方便,避免以往反复清洗铝槽造成的无机磷丢失,提高实验结果的准确性。由于32p的放射性较强,反应载体的改变可以大幅缩短操作者与辐射物接触的时间。⑩密封金属盘:在小管钠泵活性测定的各个环节中,保证小管环境的相对密闭性,防止反应液蒸发或与水雾混合,是本实验成败的关键因素之一,使用保鲜膜密封金属盘,经济实用。
这种改良方法,基本原理和肾小管钠泵活性测定结果与doucet的方法一致,但方法改良后,简化了实验条件,降低了实验成本,缩短了操作时间,能大幅度提高实验成功率。
【参考文献】
1 doucet a, katz ai, morel f. determination of nakatpase activity in single segments of the mammalian nephron[j]. am j physiol renal fluid electrolyte physiol, 1979, 237(2):105113.
2 刘红,罗蕾,高原. 2型糖尿病大鼠近球na+k+atpase活性变化[j]. 第三军医大学学报.2006, 28(20): 20622064.
3 cheval l, doucet a. measurement of nakatpasemediated rubidium influx in single segments of rat nephron[j]. am j physiol renal fluid electrolytephysiol, 1990, 259(1): 111121.
4 levillain o, huscitharel a. ornithine decarboxylase along the mouse and rat nephron. am j physiol. 1998, 274(6 pt 2): 10201028.
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