【关键词】 gst融合表达 戊型肝炎病毒 单克隆抗体 抗原表位
identification of a novel antigenic epitope on gst fusion-expressed and orf2-encoded proteins of hepatitis e virus
liang jiu-hong, liang li-min△, dong min, han zhen-ge, dong chen, meng ji-hong*
department of microbiology and immunology, school of medicine, southeast university, nanjing 210009, china
［abstract］ aim: to investigate the effect of a gst tag on the antigenic structure of gst fusion-expressed and orf2-encoded recombinant proteins of hepatitis e virus (hev). methods: the monoclonal antibodies (mab) were prepared with a gst fusion protein, p166chn-gst, which was derived from a chinese hev strain. then they were tested by indirect elisa, competition elisa and western blot with different gst fusion, his fusion or non-fusion recombinant proteins derived from hev reference strains of all 4 genotypes and other non-hev recombinant proteins. results: three mab named 1a8, 9b4 and 8h10 were obtained. all of them reacted to p166chn-gst but did not react to gst. mab 1a8 and 9b4 reacted to 4 p166-gst proteins of different hev genotypes and 2 n- or c-terminal truncated p166chn-gst proteins named p146chn-gst and p137chn-gst, but they did not react to 4 p166-his proteins of different hev genotypes and a non-fusion p179chn protein. no detectable signals were found when 1a8 and 9b4 were subjected to hev antigen competition elisa or western blot after sds-page. no cross reaction was observed between the two mab and hev-irrelevant gst fusion proteins, either. conclusion: a novel antigenic epitope recognized by mab 1a8 and 9b4 appears on the gst fusion-expressed and orf2-encoded hev recombinant proteins and it is dependent on the conformational folding of both gst and hev sequences.
［keywords］gst fusion-expression; hepatitis e virus; monoclonal antibody; antigenic epitope
体外表达的基因工程重组蛋白能够模拟微生物结构或功能蛋白的生物学活性, 因而在病原微生物研究的各个领域应用广泛。为了正确折叠和方便制备的需要, 重组蛋白常常与谷胱甘肽硫转移酶（gst）、 聚组氨酸（nhis）等蛋白标签融合表达。但是融合表达也会带来新的问题, 可能改变目的蛋白的空间结构, 影响其抗原性, 甚至在用于抗体检测时出现假阳性［1］。我们在研究戊型肝炎病毒（hepatitis e virus, hev）结构蛋白抗原表位特征时, 发现用带gst标签的hev重组蛋白p166chn-gst制备的部分单克隆抗体（mab）与带his标签的p166chn-his不反应。为研究这些mab所识别的抗原表位特征, 我们应用hev不同基因型4个代表株重组蛋白p166的gst融合蛋白和his融合蛋白、 非融合蛋白p179chn、 gst融合的p166截短蛋白、 与hev无关的其他gst融合蛋白以及gst蛋白, 作了仔细的抗原表位鉴定, 证实gst可以和与它融合表达的重组蛋白共同形成新的抗原表位。
1 材料和方法
1.1 材料 pet-28a载体和大肠杆菌bl21菌株购自novagen公司; ni-nta树脂购自上海申能博彩生物制品公司; balb/c小鼠购自扬州大学比较医学中心; p166蛋白为hev orf2编码蛋白c端166个氨基酸（452-617aa）的基因工程重组蛋白, 含有hev构象依赖型中和抗原表位［2］, hev 4个基因型代表株p166的gst融合蛋白p166mor-gst（摩洛哥株）、 p166mex-gst（墨西哥株）、 p166us-gst（美国株）和p166chn-gst（中国株）［3］, n端和c端同时截短的蛋白p146chn-gst（460-605aa）和p137chn-gst（465-601aa）, n端延长13aa的非融合蛋白p179chn（439-617aa）［4］, g-ns3、 g-ns4和g-cr分别为丙型肝炎病毒ns3蛋白、 ns4蛋白和核心蛋白的gst融合蛋白, mab anti-gst为以gst为免疫原制备的mab, mab 5g5为以p166chn-gst为免疫原制备的mab, hrp-5g5为辣根过氧化物酶（hrp）标记的mab 5g5, mice pre-immune sera为balb/c小鼠免疫前血清, anti-p166 mice sera为p166chn-gst免疫balb/c小鼠制备的小鼠多克隆抗血清，均由东南大学医学院病原生物学和免疫学实验室制备保存; t2为人疱疹病毒6型gst融合蛋白, 由南京医科大学卢春教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1 抗hev mab的制备 以p166chn-gst重组蛋白为免疫原, 免疫6~8周龄雌性balb/c小鼠, 采用常规方法制备和筛选mab, 具体方法参见文献［3］。获得3株稳定分泌mab的杂交瘤细胞株, 分别命名为1a8、 9b4和8h10, 这3株mab均能与其免疫原p166chn-gst反应, 而不与gst发生反应（图1）, 提示这3株mab为识别p166chn-gst重组蛋白的特异性抗体。
图1 mab与hev不同基因型p166-gst重组蛋白的elisa鉴定（略）
fig 1 elisa reactivity of mab to p166 recombinant proteins derived from hev different genotypes
1.2.2 hev orf2重组蛋白p166的his融合蛋白的制备 以基因型特异性引物分别扩增hev摩洛哥株、 墨西哥株、 美国株和中国株编码orf2 c端第452- 617aa的基因片段, 插入pet-28a载体构建重组质粒, 转化大肠杆菌bl21菌株, 表达p166-his融合蛋白, 经ni-nta树脂亲和层析纯化, 得到4种代表hev不同基因型的带his标签重组蛋白, 分别命名为p166mor-his、 p166mex-his、 p166us-his和p166chn-his。
1.2.3 间接elisa鉴定 分别以p166mor-gst、 p166mex-gst、 p166us-gst、 p166chn-gst、 p166mor-his、 p166mex-his、 p166us-his、 p166chn-his为包被抗原, 采用间接elisa鉴定所制备的mab。同时用纯化的gst蛋白、 t2、 g-ns3、 g-ns4、 g-cr, 以及非融合表达的p179chn重组蛋白作为抗原对照, mab anti-gst及pre-immune mice sera和anti-p166 mice sera作为抗体对照。具体方法参见文献［3］。
1.2.4 hev抗原竞争elisa鉴定 mab（培养上清）分别与hev中国株实验感染猴粪便悬液、 正常猴粪便悬液（阴性对照）和pbs（空白对照）于1.5 ml离心管中等量混合, 37℃孵育1 h, 离心取其上清分别加入预先以p166chn-gst包被的酶标反应板中, 进行竞争elisa, 以a450值降低>50%为竞争抑制阳性。计算公式为［1-a450（hev）］/a450（pbs）×100%。
1.2.5 hrp-5g5竞争elisa鉴定 mab（培养上清）与1∶100稀释的hrp-5g5等量混合, 分别加入预先以p166chn-gst包被的酶标反应板中, 37℃孵育40 min, tmb底物显色, 进行竞争elisa, 以a450值降低>50%为竞争抑制阳性。计算公式为［1-a450（mab）］/［a450 hrp-5g5（pbs）］×100%。
1.2.6 western blot检测 各株mab分别与4种p166-gst重组蛋白、 4种p166-his重组蛋白及gst蛋白按照文献［3］的方法进行western blot实验。以mab anti-gst为对照。
2 结果
2.1 hev不同基因型p166-gst重组蛋白鉴定 以4种不同基因型hev p166-gst重组蛋白（p166mor-gst、 p166mex-gst、 p166us-gst和p166chn-gst）为包被抗原, 采用间接elisa法鉴定mab的抗原表位识别特性, 1a8、 9b4和8h10除了能与其免疫原p166chn-gst反应外, 还能与p166mor-gst、 p166mex-gst和p166us-gst发生反应（图1）。说明1a8、 9b4和8h10识别的抗原表位是不同基因型p166-gst重组蛋白的共同性抗原表位。
2.2 hev抗原竞争抑制试验鉴定 为了鉴定所制备的mab识别的抗原表位与hev病毒颗粒上天然存在的抗原表位的关系, 设计了hev抗原竞争elisa, 使用hev实验感染猴发病期的粪便悬液作为竞争抗原, 与包被的重组抗原竞争结合mab。mab 8h10竞争抑制率>50%, 竞争抑制试验阳性（表1）, 说明8h10表位是hev病毒颗粒上天然存在的抗原表位。mab 1a8和9b4竞争抑制率<50%, 竞争抑制试验阴性（表1）, 说明1a8和9b4识别的抗原表位不是hev病毒颗粒上天然存在的抗原表位, 只存在于p166-gst融合蛋白中。
2.3 hrp-5g5竞争抑制试验鉴定 进一步鉴定mab 1a8、 9b4和8h10 2种mab识别抗原表位的特征, 应用所制备的mab与hrp-5g5竞争包被的抗原, 进行竞争抑制试验（表2）。 mab 8h10和5g5对hrp-5g5的竞争抑制率均>50%, 说明8h10与5g5所针对的抗原表位相同, 或存在空间位阻。而1a8、 9b4竞争抑制率<50%, 说明1a8和9b4表位与5g5、 8h10表位无关, 再次印证了以上试验结果, 提示a8和9b4表位与8h10表位不是相同的抗原表位。
表1 mab的hev抗原竞争elisa鉴定（略）
tab 1 characterization of mab by antigen competation elisa
表2 mab的hrp-5g5竞争elisa鉴定（略）
tab 2 characterization of mab by hrp-5g5 competation elisa
2.4 带不同蛋白标签和不同大小的hev orf2重组蛋白鉴定 进一步采用带his标签的4种p166-his重组蛋白（p166mor-his、 p166mex-his、 p166us-his、 p166chn-his）作为包被抗原, 检测3株mab。8h10能与相应的p166chn-his反应, 同时能与另外3种p166-his蛋白反应。而1a8和9b4与4种p166-his均不反应（图2）, 提示hev p166上不存在1a8和9b4识别的抗原表位。结合1a8和9b4也不与gst发生反应, 推测其识别的抗原表位可能是gst和p166氨基酸序列共同形成的新的抗原表位。n端延长13aa的无蛋白标签的重组蛋白p179chn间接elisa鉴定, 8h10同样能和p179chn反应, 而1a8和9b4不反应（图2）, 进一步说明8h10表位是hev特异性抗原表位, 而1a8和9b4表位不是hev编码序列的特异性抗原表位。n端和c端同时截短的hev orf2重组蛋白p146chn-gst（460-605aa）和p137chn-gst（465-601aa）间接elisa鉴定, 3株mab都表现出了良好的反应性（图2）, 提示8h10抗原表位位于hev orf2编码蛋白的465-601aa之间, 而1a8和9b4识别的表位是gst和hev orf2编码蛋白的465-601aa区段氨基酸序列共同形成的新的空间构象型抗原表位。
图2 mab与不同蛋白标签和不同大小的hev orf2重组蛋白的elisa鉴定（略）
fig 2 elisa reactivity of mab to hev orf2 recombinant proteins with different tags or sizes
2.5 gst融合的hev无关蛋白鉴定 采用gst融合表达的非hev抗原g-cr、 g-ns3、 g-ns4和t2蛋白, 进行elisa鉴定, 发现3株mab与这些hev无关蛋白均不反应（图3）, 再次证实8h10表位是hev特异性抗原表位, 而1a8和9b4识别的表位是gst和p166氨基酸序列共同形成的新抗原表位, 具有序列特异性。
图3 mab与gst融合的hev无关蛋白的elisa鉴定（略）
fig 3 elisa reactivity of mab to gst fusion proteins irrespective with hev
2.6 western blot鉴定 应用4种p166-gst重组蛋白和4种p166-his重组蛋白以及纯化的gst蛋白, 对3株mab进行western blot鉴定。用于对照的anti-gst与gst及gst融合蛋白反应阳性, anti-p166与各p166的gst/his融合蛋白反应良好。8h10与各p166-gst、 p166-his重组蛋白、 p179和gst的反应性与elisa结果一致, 而1a8和9b4在western blot试验中与各蛋白均无反应性, 提示1a8和9b4所针对的空间构象型抗原表位, 不耐受sds-page的变性电泳条件。
3 讨论
gst融合表达系统表达水平高, 通用性好, 已经商品化, 在生物医学研究的各个领域应用广泛。但gst相对分子质量(mr)大, 融合表达的gst mr约26 000, 可能对目的蛋白的空间结构产生影响, 改变其抗原性。这种影响一直未取得客观的证据, 也未能引起足够的重视。
hev难以培养, 又没有合适的小动物模型, 要获得大量的病毒十分困难, 因而都采用体外表达其结构蛋白来进行研究, 其中gst融合表达系统应用最多［3, 4］。我们应用hev中国株orf2编码蛋白p166chn-gst为免疫原制备mab, 以p166chn-gst反应阳性、 gst阴性为标准进行杂交瘤细胞株筛选。在获得的3株mab中, 1a8和9b4呈现出不同寻常的反应性, 它们与所免疫的p166chn-gst及其他3种代表hev不同基因型的p166-gst均反应, 而与相应的4种p166-his不反应, 与无蛋白标签的p179chn也不反应, 尤其是以hev病毒颗粒进行的抗原竞争抑制试验阴性, 提示1a8和9b4识别的抗原表位不是hev病毒颗粒上天然存在的抗原表位, 只存在于p166的gst融合蛋白中, 是p166与gst蛋白共同形成的新的抗原表位。1a8和9b4与p166 n端和c端截短蛋白p146chn-gst（460-605aa）、 p137chn-gst（465-601aa）反应阳性, 说明该表位不是线性表位, 而是构象依赖型抗原表位。这种推测同时被western blot试验所证实。与elisa检测不同的是, 1a8和9b4在western blot试验中失去了与有关蛋白的反应性, 说明它们所针对的构象型抗原表位结构不稳定, 能被sds-page的变性条件所破坏; 而同样针对构象型抗原表位的8h10在western blot试验中结果与elisa一致阳性, 这并不矛盾, 说明1a8和9b4表位与8h10表位的特征不同, 8h10表位结构十分稳定, 这在我们先前的实验和其他学者的研究中已有报道［3, 5, 6］。另外, 与hrp-5g5的竞争抑制试验, 1a8和9b4阴性, 而8h10阳性, 充分说明1a8和9b4与8h10针对的是不同的抗原表位。因1a8和9b4与gst融合的hev无关蛋白不反应, 提示新表位确实是gst与hev orf2编码蛋白465~601 aa序列共同形成的, 具有序列特异性。
本实验证实gst与融合表达的重组蛋白可以形成新的抗原表位, 有可能影响重组蛋白的结构和抗原特征, 造成结果偏差。虽然公司可提供凝血酶用于切除gst部分获得目的蛋白, 但是效率不高, 蛋白回收比率低, 可能造成蛋白溶解度降低, 免疫原性减弱, 实际较少应用。因而就要注意排除新表位形成可能造成的影响, 如制备mab, 在筛选时只看gst融合蛋白阳性、 gst阴性, 就可能引起差错。另外, 新抗原表位可能会引起交*反应, 影响检测的特异性, 因而开发诊断试剂时要充分注意这种影响。此外, gst可以和融合的重组蛋白形成新的表位, 那么也有可能影响或掩盖重组蛋白上呈现的固有抗原表位, 因而在病原生物结构和功能的研究中, 应详加分析, 多方鉴定。
【参考文献】
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