作者：于彬，韩鹃，梅峰作者单位：第三军医大学基础部组织学与胚胎学教研室，重庆 400038
【摘要】 目的探讨在新生小鼠小肠cajal间质细胞（interstitial cells of cajal，icc）的发育过程中是否出现增殖。方法采用新生2 d（p2d）、14 d（p14d）和24 d（p24d）的小鼠小肠，应用brdu腹腔注射，24 h后取材，kit和brdu免疫荧光染色。结果p2d小鼠小肠，可见大量kit/brdu双重标记阳性细胞，这些细胞的形态与成熟icc基本相似，这些细胞在p14d时减少，而在p24d消失。统计学分析发现，不同时间点之间kit/brdu双标阳性细胞数量存在显著差别（p＜0.05）。结论在小肠生后发育过程中，出现了icc增殖，而这种增殖在发育过程中逐渐减弱，最后在成年前消失。
【关键词】 cajal间质细胞；增殖；kit蛋白；brdu
a study on interstitial cells of cajal proliferation in murine small intestine during postnatal peroid
yu bin, han juan, mei feng (department of histology and embryology, third military medical university, chongqing 400038, china)
abstract: objective to investigate the appearance of interstitial cells of cajal proliferation during postnatal development. methods postnatal mice aged 2 days (p2d), 14 days (p14d) and 24 days (p24d) were used, and intraperitoneally injection of brdu was carried out 24 hours before sacrifice. immunohistochemcal staining with either kit or brdu antibody was performed to reveal the proliferative icc. results kit/brdu double labeling cells were found out in the small intestine of 2days old mice, and these cells were similar with mature ones in features. and those cells reduced at p14d and vanished at p24d. conclusion our result indicated that icc proliferate during the postnatal development, and the proliferation gradually reduced and vanished before adulthood.
keywords: interstitial cells of cajal; proliferation; kit; brdu
cajal细胞（interstitial cells of cajal，icc）是100多年前cajal应用镀银技术和甲基蓝染色，在豚鼠和家兔小肠描述的一种特殊的间质细胞，现通常称为cajal细胞或icc。在小肠内环行平滑肌和纵行平滑肌之间，肌间神经丛周围分布着icc，这些细胞呈网络状分布，是小肠自主节律性运动的起搏细胞和兴奋传导细胞［13］。近年研究表明icc与一些胃肠运动功能障碍性疾病，如贲门失迟缓症、糖尿病性胃轻瘫以及慢性便秘等密切相关［4］。尽管这些疾病发生机制尚不清楚，但均可见icc数量存在不同程度减少，细胞网络完整性被破坏等病理改变。研究发现新生儿先天性巨结肠、假性肠梗阻等疾病中［5］，都存在icc细胞的丢失，或缺失，提示生后icc的变化可能与胃肠道运动功能障碍性疾病的发生有关。目前对动物生后icc的发育研究发现，icc在小鼠出生时出现，而且这些细胞在大约48 h内发育成熟成为具有自主节律性的起搏细胞［6］。在生后发育过程中，小肠的直径和长度都发生了巨大的变化，成年小鼠小肠的直径和长度是新生小鼠的数十倍。我们在前期的研究过程中观察到，成年动物icc没有增殖现象，而icc在生后发育过程中，是否出现细胞增殖，尚未见报道。因此，本研究采用brdu腹腔注射，观察24 h后，通过标记icc的特异性标志物kit蛋白，同时观察brdu是否掺入kit阳性细胞，期望了解动物生后icc是否出现了增殖。
1材料与方法
1.1材料新生2、14、24 d小鼠（第三军医大学实验动物中心提供），雌雄不限，分为三组，新生2 d为p2d组，14 d为p14d组，24 d为p24d组，每组3只动物，共9只小鼠。kit单克隆抗体购自ebioscience公司，cy3标记的兔抗大鼠igg抗体、brdu单克隆抗体和fitc标记的羊抗小鼠igg抗体均购自dako公司。
1.2方法
1.2.1brdu注射三组小鼠在取材前24 h给予brdu腹腔注射（0.3 mg/g）。
1.2.2免疫细胞化学染色brdu注射24 h后取各组小鼠小肠，0.01 mol/l pbs冲洗小肠，100%丙酮固定小肠20 min，解剖显微镜下，用镊子撕去小肠的粘膜层和粘膜下层，获得小肠平滑肌层铺片。pbs漂洗3次，每次5 min。1%bsa孵育30 min后加入第一抗体，kit单克隆抗体（1∶100）4 ℃ 48 h，cy3标记的兔抗大鼠igg抗体（1∶100）25 ℃ 60 min。随后4%多聚甲醛固定10 min，2 mol/l hcl处理标本30 min（室温），pbs漂洗3次，每次5 min，加入第二个一抗，brdu单克隆抗体（1∶100）4 ℃ 48 h，fitc标记的羊抗小鼠igg抗体（1∶100）25 ℃ 60 min。水溶性封片剂封片。激光共聚焦显微镜（leica tcs sp5）或者荧光显微镜观察照相，cy3和fitc分别用528 nm和488 nm光波激发。对照实验以正常鼠血清代替一抗，或兔血清代替二抗，各步骤间用pbs漂洗3次。
1.3半定量分析及统计学处理选各组铺片5张，荧光显微镜下随机选择10个视野，统计kit阳性和kit/brdu双标记阳性的细胞数量，统计结果用spss11.0软件进行单因素方差分析，p＜0.05具有显著性差异。
2结果
kit免疫荧光显示，kit阳性的icc在肌间神经丛周围呈网络状分布，p2d组icc网络基本形成，但是细胞数量较少，而且细胞的突起较少（图1a），说明此时的icc多为幼稚细胞。p14d组小鼠小肠icc细胞密度较高，形成较完整的细胞网络（图1b）。p24d组小肠icc具有粗大的初级突起和多个次级突起，这些突起相互之间连接成细胞网络（图1c）。统计结果显示生后不同时期icc的细胞密度存在明显差别（p＜0.05）。
a：生后2 d，icc细胞数量较少，细胞突起较细而稀疏；b：生后14 d可见icc的突起较粗大并有多级分支，形成细胞网络；c：生后24 d，icc细胞网络完整，可见细胞突起相互连接
图1kit免疫荧光染色显示生后不同时期小鼠小肠icc的变化
brdu染色标记在细胞核，kit/brdu双重免疫荧光染色显示，在p2d组小肠存在较多双标记阳性细胞，这些细胞的外形与成熟icc略有不同，细胞的突起较细而稀少（图2a～c），计数显示双标记阳性细胞密度约为178个/mm2。p14d组双标记阳性细胞减少，大约为100个/mm2，此时双标记阳性细胞的形态与成熟icc基本相似（图2d～f）。而在p24d组未见双标记阳性细胞出现（图2g～i），说明接近成年时icc增殖已停止。统计学分析，各组kit/brdu双标记阳性细胞数量存在显著差异（p＜0.05）。对照实验结果均为阴性。3讨论本研究组最近研究发现，胎儿小肠壁内icc在妊娠9～12周出现后，数量随胎龄增加而增多，突起逐渐延长，至胚胎中晚期icc彼此间形成完整的细胞网络。kluppel等报道在小鼠胚胎期12～14 d可见icc出现［7］，随后icc逐渐增多，构成肌间神经丛周围的icc细胞群，出生后数日内icc的数量可迅速增加到出生时的3倍以上。体外培养研究也表明，在干细胞因子（stem cell factor，scf）存在下，小鼠胚胎期18 d和出生后2 d的icc具有增殖能力［8］，且在一定范围内与scf的浓度呈正相关。以上结果提示在胚胎发育阶段，icc具有一定的增殖能力，细胞突起亦能生长延长。成年动物注射brdu，标记分裂、增殖的细胞，但未能发现icc呈brdu阳性，推测可能与icc的存活时间较长、更替慢、正常情况下难以捕捉有关［9］。出生后icc是否仍然具有增殖能力尚未见报道。本研究通过在小鼠生后的不同时期给予注射brdu，证明新生小鼠icc具有增殖能力，并随着年龄增长逐渐降低，成年后消失。
a～c：生后2 d，可见较多kit/brdu双重免疫荧光染色阳性细胞，细胞突起细长而稀少；d～f：生后14 d，可见双标记阳性细胞数量减少，细胞的突起较长而粗大；g～i：生后24 d，未见双标记阳性细胞；箭头所指为icc
图2kit/brdu双重免疫荧光染色显示生后不同时期小鼠小肠icc的增殖情况，红色为kit染色，绿色为brdu染色
本实验观察到在生后2 d，kit/brdu双标记阳性细胞较多，这些细胞突起短而细，胞浆丰富，形态上属于幼稚型细胞，推测这部分增加的icc可能来源于未分化的间充质细胞。有报道icc与平滑肌细胞可能源于同一前体细胞(progenitor cells)［10］，因而这些icc的来源可能是间充质干细胞或者前体细胞。从本研究icc增殖的过程看，icc的数量在新生2 d最多，随后逐渐减少，最后成年前消失。证明icc的增殖是依赖于年龄的。已证明kit蛋白在icc持续大量表达，对维持icc的正常结构和细胞网络的完整性及功能具有重要作用。据报道用kit蛋白的中和性抗体(ack2)注射0～5 d新生小鼠［11］，可见其肠壁内icc发育受阻，生后icc的数量仍保持在出生前的水平，不足以形成完整的细胞网络。kit蛋白的生理作用发挥需要与其配体scf结合，当小鼠编码scf的steel基因突变后，肌间神经丛的icc明显减少，甚至缺如。体外培养也显示胚胎期18 d和出生后2 d的小鼠icc，在scf存在的条件下具有一定的增殖能力，上述研究均表明kit/scf信号通路对icc的分裂增殖和正常发育具有重要的调节作用［12］。因此，本文认为本实验icc增殖过程中kit/scf信号通路有重要作用。综上所述，本研究采用brdu注射的方法检测新生小鼠小肠icc的增殖，证明新生小鼠小肠icc具有增殖能力，而且这种增殖能力随着年龄增长逐渐降低，成年前消失。如果在小肠发育过程中，icc增殖受阻就可能导致icc细胞数量不足，从而导致胃肠道运动功能障碍。这对研制以icc为靶点治疗胃肠运动功能障碍性疾病的药物提供了新的理论依据。
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