重组抗cd25人源化单克隆抗体，人源化单克隆抗体应用前景

今天中国论文网小编为大家分享毕业论文、职称论文、论文查重、论文范文、硕博论文库、论文写作格式等内容.

【摘要】 本研究探讨人源化重组cd25单克隆抗体（rhcd25mab）对外周血t淋巴细胞活化、增殖的影响。应用植物血凝素（pha）刺激外周血单个核细胞，不加或同时加rhcd25mab或环孢菌素a(csa)进行体外培养, 或先用pha刺激t细胞活化后再加入rhcd25mab继续进行培养。用mtt法检测淋巴细胞增殖率；流式细胞术检测t淋巴细胞表面抗原cd3、cd25的表达；elisa方法检测细胞培养上清液中可溶性il2r(sil2r)水平。结果显示：rhcd25mab和csa均能有效抑制pha活化的t细胞的增殖，且随浓度的升高而增强，总体比较，csa对t细胞的增殖抑制作用更强。虽然csa和rhcd25mab均能降低细胞培养上清中的sil2r的水平及cd25＋/cd3＋的比例，但rhcd25mab的作用明显强于csa。rhcd25mab无论是在t细胞活化前还是活化后均能抑制t细胞表达cd25抗原和分泌sil2r。结论：rhcd25mab具有很强的免疫抑制作用，它能抑制t细胞活化及抑制活化的t细胞增殖，临床上它不仅可用于治疗急性移植物抗宿主病（agvhd），还可用于预防agvhd。

【关键词】 人源化抗cd25单克隆抗体 t 可溶性白介素2受体 细胞表面抗原

effects of humanized recombinant cd25 monoclonal antibody on activation and proliferation of t lymphocytes

liu wei, ren hanyun

department of hematology，the first hospital, peking university， beijing 100034， china

abstract the study was purposed to investigate the effects of humanized recombined cd25 monoclonal antibody (rhcd25mab) on activation and proliferation of t lymphocytes in vitro. peripheral blood mononuclear cells (pbmnc) were incubated with phytohemagglutinin (pha). before or after t cell activation, the cells were cultured with or without rhcd25mab or cyclosporine a (csa) in vitro. after 72 hours incubation, the proliferation of lymphocytes was analyzed by mtt assay. the expression of cd3 and cd25 antigens on t lymphocytes were detected by flow cytometry. the levels of sil2r in the supernatants were determined with elisa. the results showed that both rhcd25mab and csa could inhibit the proliferation of t lymphocytes significantly in concentrationdependent manner and csa was more efficient than rhcd25mab. both rhcd25mab and csa could also decrease the levels of sil2r in the supernatant and inhibit the expression of cd25 antigen on t lymphocytes. the level of sil2r and the expression of cd25 on t lymphocytes decreases more profoundly in rhcd25mab group. it is concluded that rhcd25mab shows strong immunosuppressive activity both before and after t cell activation, suggesting that this agent may be useful in not only prophylaxis but also the treatment of acute graftversushost disease.

key words humanized recombined cd25 monoclonal antibody; t lymphocyte; sil2r; cell surface antigen

j exp hematol 2007; 15(1):134-137

rhcd25mab是一种新型的基因工程抗体，主要用于预防器官移植术后的急性排异反应［1］，近年在治疗异基因造血干细胞移植术后的移植物抗宿主病（gvhd）中也具有良好疗效［2-5］。d25mab可与激活的t细胞表面的高亲和力的白介素2（il2）受体α亚单位特异性结合，从而阻断il2与il2r的结合，抑制t细胞活化而发挥免疫抑制作用。本研究观察了该抗体在体外对t细胞增殖和活化的影响，并与环孢霉素a（csa）的免疫抑制作用进行了比较，以进一步指导rhcd25mab在异基因造血干细胞移植临床中的应用。

材料和方法

主要试剂

rhcd25mab为美国罗氏公司产品；csa为瑞士sandoz公司产品；植物血凝素（pham）、mtt购自美国sigma公司；异硫氰酸荧光素（fitc）标记的小鼠抗人cd25单克隆抗体购于美国exalpha公司；藻红蛋白（pe）标记的鼠抗人cd25单克隆抗体（pecd25）和pe标记的鼠抗人cd3抗体（pecd3）购于美国becton dickinson公司；可溶性il2受体（sil2r） elisa检测试剂盒为法国狄龙公司产品，检测敏感度为8 pg/ml；rpmi 1640培养液购于gibco公司。

细胞增殖抑制率的mtt测定

取健康志愿者新鲜肝素抗凝外周血应用ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，以浓度为1×106/ml接种于96孔板中，每孔100 μl， 分别加 pha 5 μl/well，使终浓度为10 μg/ml，并加入各浓度的csa或 rhcd25mab 5 μl/well，使终浓度为所需浓度。于5％ co2、37℃、全湿度条件下培养72小时后，每孔加入5 mg/ml的mtt溶液10 μl/well，继续培养4小时后，加10％酸化的sds 100 μl/well，再继续培养14－16小时后，用酶标仪于波长570 nm处测定od值。求平均值后根据公式：

增殖抑制率（％）＝（药物组od值/对照组od值）× 100％

求不同浓度的csa或rhcd25mab对t细胞增殖的影响。

淋巴细胞培养上清液中的sil2r水平的测定

取所提取的pbmnc，以浓度为1×106/ml接种于24孔板中，每孔1 ml。加入rpmi 1640培养液10 μl/well的为对照组；其余每孔分别加入pha 5 μl/well，使终浓度为10 μg/ml。pha刺激组：只加入pha。csa预防组：与pha同时加入csa 5 μl/well，使其终浓度为500 ng/ml。rhcd25mab预防组：与pha同时加入rhcd25mab 5 μl/well，使其终浓度为10 μg/ml。以上各组细胞在5％co2、37℃、全湿度条件下培养72小时后，吸出细胞悬液置于1.5 ml eppendorf管中，1 500 rpm离心8分钟后收集上清，-20℃保存以备sil2r测定。应用流式细胞仪测定淋巴细胞表面抗原。rhcd25mab治疗组：加入pha培养72小时后，再加入rhcd25mab 5 μl/well，使其终浓度为10 μg/ml，再培养72小时后，分别测定上清sil2r和淋巴细胞表面抗原。

淋巴细胞表面活化抗原的流式细胞术检测

将已收集过上清的细胞应用pbs洗涤2次后，重悬于100 μl pbs中，加入pecd3 单克隆抗体5 μl/106细胞及fitccd25 单克隆抗体（10 μl/106细胞），避光孵育15分钟，用pbs再次洗涤1次后，重悬于0.5 ml pbs中，用流式细胞仪进行检测。

统计学处理

实验数据采用均值±标准差（±sd）进行方差分析比较，p﹤0.05为具有显著性差异。

结 果

rhcd25mab、csa对于pha诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用

rhcd25mab和csa均能有效的抑制pha诱导的淋巴细胞增殖，但csa对增殖的抑制作用较rhcd25mab明显。csa的抑制作用在低浓度时表现出明显的浓度依赖性，即随浓度的升高抑制作用逐渐增强；当浓度达到300－500 ng/ml时抑制作用最强，其后基本维持在一平台水平（图1a）。rhcd25mab对于pha诱导的淋巴细胞激活的抑制作用随其浓度的升高而增强，至浓度5－10 μg/ml尚未达到最大增殖抑制作用（图1b）。

figure 1. concentrationdependent inhibitory effect of cyclosporin a (a) and rhcd25mab (b) on phainduced lymphocyte proliferation.

rhcd25mab、csa对pha诱导激活的淋巴细胞培养上清中sil2r水平的影响

pha与pbmnc共同培养72小时后，pbmnc分泌的sil2r与空白对照组相比提高了148.5倍。当csa、rhcd25mab分别与pha和pbmnc共同培养72小时（分别称为csa预防组和rhcd25mab预防组）后，csa只能轻度降低培养上清中sil2r水平，而rhcd25mab则能明显降低其上清中sil2r的浓度。当先用pha激活pbmnc后，再加入rhcd25mab培养72小时（rhcd25mab治疗组），亦能明显降低培养上清中sil2r的水平，这表明rhcd25mab无论对预防t细胞活化还是抑制活化细胞表达il2r的作用均强于csa（表1）。

rhcd25mab及csa对于pha诱导激活的t淋巴细胞表达cd25影响的比较

pha与pbmnc共同培养72小时后，cd25＋t细胞百分率与对照组相比提高了4.33倍。当csa、rhcd25mab分别与pha和pbmnc共同培养72小时（csa预防组和rhcd25mab预防组）以及在pha激活t细胞后再加入rhcd25mab培养72小时（rhcd25mab治疗组）后均能降低cd25＋t细胞的百分率，csa预防组降低了8.86％，rhcd25mab预防组下降了49.91％，rhcd25mab治疗组下降了65.05％。由此可见，rhcd25mab无论是pha激活前还是pha激活后加入培养体系均能抑制t淋巴细胞的激活，这种作用明显强于csa（表2，图2）。

讨 论

急性移植物抗宿主病（agvhd）主要是供者的t淋巴细胞识别宿主的不相合的抗原，并对其产生免疫应答而造成宿主组织的不同程度的损伤，临床上出现各种症状。在这一过程中，t淋巴细胞的活化、增殖起着关键作用。活化的t淋巴细胞分泌il2并表达il2r，il2r分为α、β和γ三部分，其中α链（cd25）为il2r的特异性受体，只在活化的t淋巴细胞表面表达，sil2r是其胞膜外部分。当il2与其受体il2r结合后能激活细胞内信号传导途径，诱导t淋巴细胞活化并促进增殖［6］。因此可通过阻断il2和il2r的结合，抑制t淋巴细胞的活化而防治agvhd。

研究表明，在体外实验中rhcd25mab能抑制pha诱导的t细胞增殖，尤其在混合淋巴细胞培养中作用更强［7］。本研究亦发现rhcd25mab与csa一样，均能明显抑制pha诱导的淋巴细胞的增殖。rhcd25mab的增殖抑制作用随浓度的升高而加强，在浓度为5－10 μg/ml尚未达到最大抑制作用，表明t淋巴細胞活化可能还有其它因素的参与；csa在低浓度水平抑制作用与浓度有明显依赖性，但是在300-500 ng/ml这一水平达到高峰。由于rhcd25mab为一种单克隆抗体，通过与il2rα链的特异性结合而发挥作用，故考虑当其浓度达到与所有il2rα链结合后，即使再增加浓度也不会有明显的增强抑制作用。根据以上结果，我们认为临床应用中，当rhcd25mab达到某一浓度水平后，单纯通过加大剂量的方法并不能有效提高临床效果，而对于临床疗效差且血清sil2r快速反跳的患者，加大rhcd25mab用量是否能增加疗效仍有待证明；而对于csa，临床中则可以通过调整剂量提高其血药浓度以获得更好的疗效。

在临床上，患者经rhcd25mab治疗后会出现血清sil2r水平的降低，同时cd25＋细胞的比例明显下降［1］。本实验中，根据临床用药浓度及实验所得结果，我们分别选取rhcd25mab 10 μg/ml与csa 500 ng/ml浓度抑制pha诱导的t淋巴细胞活化，明显地降低了培养上清中sil2r水平并抑制t细胞表面抗原cd25的表达。无论是预防应用还是t细胞活化后应用均有较好的作用，且rhcd25mab效果明显强于csa。rhcd25mab为抗il2rα链的单克隆抗体，可以直接与血清中sil2r结合并封闭细胞表面cd25抗原，而csa主要通过抑制il2的生成和释放发挥作用，这可能是造成此种差异的原因之一。我们的实验结果表明，rhcd25mab和csa同样具有较强的免疫抑制作用，且预防应用与治疗应用rhcd25mab可能都会获得良好的效果。

临床资料表明，应用rhcd25mab治疗糖皮质激素耐药的agvhd疗效有很大的差异［2-5］。martin 等［8］应用cd25特异免疫毒素预防无血缘关系骨髓移植引起的agvhd，发现agvhd的发生率有增加的趋势。对此目前尚无很好的解释。这可能是cd25抗体通过抑制或清除cd4+cd25+免疫调节细胞（treg），使其对gvhd抑制作用减弱，或其他免疫抑制剂通过抑制t淋巴细胞cd25表达，保护了t淋巴细胞而不被cd25抗体所清除。因此，临床应用rhcd25mab进行agvhd预防或治疗时，还要考虑加重gvhd可能性。

【参考文献】 1waldmann ta, levy r, coller bs. emerging therapies: spectrum of applications of monoclonal antibody therapy. hematology (am soc hematol educ program), 2000: 394-4082przepiorka d, kernan na, ippoliti c, et al. daclizumab, a humanized antiinterleukin2 receptor alpha chain antibody, for treatment of acute graftversushost disease. blood, 2000; 95:83-893schmidthieber m, fietz t, knauf w, et al. efficacy of the interleukin2 receptor antagonist basiliximab in steroidrefractory acute graftversushost j haematol, 2005；130：568-5744willenbacher w, basara n, blau iw, et al. treatment of steroid refractory acute and chronic graftversushost disease with daclizumab. br j haematol, 2001;112: 820-8235lee sj, zahrieh d, agura e, et al. effect of upfront daclizumab when combined with steroids for the treatment of acute graftversushost disease: results of a randomized trial. blood, 2004;104:1559-15646nelson bh, willerford dm. biology of the interleukin2 receptor. adv immunol, 1998;70:1-817kircher b, latzer k, gastl g, et al. in vitro immunosuppressive activity of new anticd25 antibodies. bone marrow transplant, 2002;29(suppl 2): s1738martin pj, pei j, gooley t, et al. evaluation of a cd25specific immunotoxin for prevention of graftversushost disease after unrelated marrow transplantation. biol blood marrow transplant, 2004;10:552-560

　　中国论文网(www.lunwen.net.cn)免费学术期刊论文发表,目录,论文查重入口,本科毕业论文怎么写,职称论文范文,论文摘要,论文文献资料,毕业论文格式,论文检测降重服务。