作者：杨小明， 何军， 柳艳君， 刘方
【摘要】 目的研究银杏酸的荧光特征，探讨光、热对银杏酸稳定性的影响。方法通过荧光扫描研究溶剂、ph值对银杏酸荧光特性的影响，建立检测银杏酸的荧光分光光度法。结果银杏酸在ph 4.0甲醇溶液中荧光强度较强，激发波长279 nm，发射波长404 nm时，银杏酸在0.221～20.31 μg/ml浓度范围内与荧光强度呈现良好的线性关系，相关系数为r=0.997 5；检测限0.023 5 μg/ml。结论银杏酸溶液对光不稳定，随光照时间延长浓度降低；银杏酸溶液在5℃时稳定，25℃时稳定性有所下降，并随温度升高或加热时间延长降解率增大。该方法可用于测定光照、加热对银杏酸的影响。
【关键词】 银杏外种皮 银杏酸 荧光分光度法 光稳定性 热稳定性
abstract：objectiveto study the fluorescence characteristics and the heat and sunlight stability of ginkgolic acid. methods the effects on fluorescence characteristics of ginkgolic acids with different solvent, different ph media were studied by fluorescence scan. a fluorescence spectrophotometry for determination of ginkgolic acids was established. resultsit was found that in the ph4.0 methanol the fluorescence signal of ginkgolic acids was the excitation and emission wavelength ginkgolic acid were at 279 and 404 nm respectively, the linear range was 0.221～20.31 μg/ml, correlative coefficient was 0.997 5, and the detection limit was 0.0235 μg/ml. conclusionginkgolic acids is unstable to sunlinght. ginkgolic acids is stable when being exposed to 5℃ condition, but its stability depressed when being exposed over 25℃ conditions. the method can be used to analyze the heat stability and sunlight stability of ginlgolic acids.
key words： ginkgolic acids; fluorescence spectrophotometry; sunlight stability; heat stability
银杏酸（ginkgolic acids, ga）属于6-烷基或者6-烯基水杨酸的衍生物，其苯环6位碳链长度13-17，双键数0-2，为5种同系物所组成的混合物，存在于银杏的叶、果和外种皮中，以外种皮中含量为高。银杏酸能抑制多种细菌、真菌的生长，并能诱导肿瘤细胞的凋亡。作者发现银杏外种皮石油醚提取物具有突出的杀钉螺活性［1］，银杏酸是其中的主要活性成分 ［2］，因此银杏酸被认为是一种极具价值的杀螺剂或先导化合物。作为一种植物来源的杀钉螺剂，银杏酸的稳定性在其使用中具有重要的意义。而到目前为止，国内外尚未见相关报道。
目前已报道的银杏酸分析方法主要有hplc-uv法［3］和hplc-ms联用法［4］、紫外分光光度法［5］和荧光分光光度法［6］。hplc法测定精密度高，但对仪器要求高，分析操作复杂，成本较高；紫外分光光度法简便但灵敏度较低；而荧光分光光度法在操作简便的同时具有较高的灵敏度。田亚平［6］以白果酸为标准品采用荧光分光光度法测定银杏外种皮中银杏酸的含量。笔者采用从银杏外种皮中分离的银杏酸为标准品研究其荧光特征时，发现与田亚平报道有所差异，因此对银杏酸的荧光特征进行详细研究，建立了荧光法测定银杏酸的方法，研究了银杏酸在不同温度条件和光照下的稳定性。
1 仪器与试剂
cary eclipse荧光分光光度计（美国varian公司）；jasco lc-1500 高效液相色谱仪（日本分光公司），配有pu-1580泵，pg-1580-54四通道在线脱气，fp-1520荧光检测器，n2000色谱工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）；sartorius bs 124s 分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。银杏酸标准品由本实验室自制，经hplc测定纯度>98%（与博士赠送的分析纯度99%以上的银杏酸对照品比较）。银杏酸标准品用无水甲醇配制成1.05 mg/ml的贮备液。银杏酸标准溶液的制备：精密吸取1.05 mg/ml的银杏酸贮备液用无水甲醇溶解定容于10 ml容量瓶，即配制成浓度为105 μg/ml的工作溶液。
其余试剂均为分析纯，水为去离子水二次蒸馏。
2 方法与结果
2.1 溶剂对银杏酸荧光强度的影响取银杏酸标准品分别以dmf、甲醇、丙酮、乙醇、正丁醇、甲醇-水（7∶3），乙腈为溶剂配成100 μg/ml进行荧光扫描；实验温度为(25±0.5)℃，激发和发射狭缝为5 nm，激发和发射单色器的扫描速度均为500 nm·min-1。银杏酸标准品在不同溶剂中的激发光谱和发射光谱分别见图1。
在丙酮溶液中银杏酸荧光特性消失；在dmf溶液中银杏酸发生荧光淬灭；在正丁醇溶液中银杏酸的发射强度很微弱。在其它4种溶液中，银杏酸都出现位于229 nm和279 nm处的两个荧光激发峰，和位于404 nm和552 nm附近的两个荧光发射峰。比较发现甲醇溶液中银杏酸激发荧光性最强。综合考虑银杏酸的激发光谱和发射光谱，选择甲醇溶液为溶剂，激发和发射波长分别为279 nm和404 nm。
2.2 ph条件对银杏酸荧光强度的影响以甲醇-水（7∶3）为溶剂，配制100 μg/ml银杏酸标准液，分别在不同ph条件下测定其荧光强度。在ph值2～8之间，使用磷酸盐缓冲体系；在ph值9.00～10.00之间，使用碳酸盐缓冲体系，荧光测定条件同“2.1”项。
测定了不同ph条件下银杏酸的相对荧光强度，结果发现随着 ph值的增加，银杏酸的荧光强度略有上升，当ph>4时，荧光性超过仪器检测最高值,这与文献［6］报道一致。因此选择在ph 4.0条件下进行荧光测定。
2.3 高效液相-荧光法分析干扰物的影响色谱条件：大连elite sino chrom ods-ap色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；荧光检测器，激发波长279 nm，发射波长404 nm；流动相：甲醇-3％hac水溶液（92∶8，v/v）；流速1.0 ml/min，柱温40℃。银杏酸标准品的高效液相-荧光色谱图见图2。由图2可见银杏酸标准品的高效液相荧光图上未见荧光杂质，故可直接采用荧光分光光度计直接进行测定。
2.4 荧光分光光度法的线性范围和检测限将银杏酸工作液稀释成一系列浓度，按试验方法分别测定在404 nm下的荧光强度，以荧光强度对相应浓度作图，绘制标准曲线。在相同条件下测定样品溶液中银杏酸的荧光强度，通过标准曲线计算其含量。
配制一系列不同浓度银杏酸工作液，按实验方法在激发波长279 nm，发射波长404 nm的条件下，以无水甲醇作为空白，测定银杏酸标准工作溶液的荧光强度，发现银杏酸浓度在0.221～20.31 μg/ml范围内与荧光强度呈现良好的线性关系，其线性回归方程为：y=44.19x+82.80，相关系数为r2=0.995； 相对标准偏差为2.1%（n=10）。取20份空白液测定其荧光强度，以3倍标准偏差计算其检测限为0.023 5 μg/ml。
2.5 准确度与精密度
2.5.1 精密度考察取0.1 mg/ml银杏酸溶液1 ml于10 ml容量瓶中，无水甲醇定容，测定其荧光强度，重复5次，得银杏酸溶液的rsd为0.47%（n=5）。
2.5.2 准确度考察取0.1 mg/ml银杏酸溶液1 ml于10 ml容量瓶中，无水甲醇定容，测定其荧光强度，重复5次，得银杏酸溶液的rsd为0.75%。
2.6 样品分析
准确称取一定量的银杏酸对照品以甲醇定容，作为样品溶液，分别按本法和文献［3］hplc-uv分析条件进行检测，结果见表1。可见荧光分光法与hplc法测定结果基本一致，因此可以采用荧光光度法进行样品中银杏酸含量的分析。表1 采用荧光光度法与高效液相色谱法测定银杏酸结果的比较（略）
2.7 银杏酸光、热稳定性准确移取银杏酸工作液15 ml于具塞比色管中，密封后分别置于5，25，40，70℃恒温，每间隔24 h取样，测定银杏酸的含量，求出分解率。每处理设置3个平行。
准确移取银杏酸工作液20 ml置于直径为9 cm的石英比色皿中，封口后将石英比色皿放置在阳光下照射（每天8 h，夜间或阴天将比色皿保存于冰箱）；一份表面皿用铝箔遮盖，并放置在阴暗处对比。每间隔24 h定时取样，测定银杏酸的含量，求出分解率。光照实验在距离地面15 m的楼顶平台进行，光照时候保持石英比色试管与太阳光线成30。角，测定光强为35 000～65 000 lx，黑暗对照以铝箔包裹同样条件下光照，每处理设置3个平行。
银杏酸置于5，25，40，70℃恒温水浴锅中分别恒温1，2，3，4，5，6 d后，银杏酸的浓度变化见图3～4。
由图3 可见,银杏酸在5℃时稳定,浓度不发生变化；温度升至25℃以上，随着处理时间的延长，浓度略有下降，温度越高，银杏酸浓度降低越多，说明高温对银杏酸的稳定性有较大影响；由图4可见，在太阳光照射下，银杏酸的浓度随照射时间的延长而降低。说明银杏酸具有热、光的不稳定性。
3 结论
本法具有简便，检测限低的特点，测定结果与hplc法基本吻合，可用于银杏酸纯品的分析。如样品中含有荧光杂质，则测定前必须进行纯化。由分析结果可知银杏酸在高温和光照条件下不稳定，在自然条件下能够降解。
【参考文献】
［1］陈盛霞，杨小明，吴亮，等.银杏外种皮提取物灭钉螺效果的研究［j］.中国寄生虫与寄生虫病杂志，2007，25（1）：45.
［2］杨小明，陈盛霞，张蓉仙，等.银杏外种皮石油醚提取物的杀钉螺活性研究［j］.中国人兽共患病学报，2006，11（10）：961.
［3］仰榴青, 吴向阳，陈钧. 高效液相色谱法测定银杏外种皮中银杏酸的含量［j］.分析化学, 2002,30（8）: 901.
［4］ndjoko k, wolfender j-l,hostettmann k. determination of trace amounts of ginkgolic acids in ginkgo biloba extracts and phytopharmaceuticals by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry［j］. j chromatogr b,2000, 744:249.
［5］仰榴青, 吴向阳，陈钧.银杏酸的分光光度法测定［j］.分析化学,2004 , 32（5）:661.
［6］田亚平,尤文元,李域娜.荧光法测定银杏酚酸［j］ .分析化学,2006,34（特刊）：s155.
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