作者：叶勇， 周莉玲， 晏亦林，黄秋洁
【摘要】 目的测定磷酸川芎嗪微透析体内回收率并对其稳定性进行考察。方法采用反透析法测定回收率，考察流速、浓度对回收率的影响。结果反透析法测定的体内回收率与媒介中磷酸川芎嗪的浓度无关，稳定性良好。结论微透析取样技术可用于磷酸川芎嗪的药动学研究，体内研究的反透析法可作为微透析研究中磷酸川芎嗪回收率的测定方法。
【关键词】 磷酸川芎嗪 微透析 体内回收率
abstract:objectiveto determine the in vivo recovery of tetramethylpyrazine phosphate(tmpp) in microdialysis probes and to study its stability．methods the recovery of tmpp was detected by retrodialysis method．the effect of flow rates and concentrations on recovery was studied．resultstmpp recovery was independent of tmpp concentration in the external medium by using retrodialysis method．tmpp recovery had good stability．conclusionmicrodialysis sampling can be used for the pharmacokinetic study of tmpp and retrodialysis method can be used for the determination of tmpp recovery in vivo．
key words:tetramethylpyrazine phosphate(tmpp)； microdialysis； in vivo recovery
微透析(microdialysis，md)技术是以透析原理作为基础的在体取样技术，是在非平衡条件(即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中浓度)下，灌注埋在组织中微透析探针，组织中待测化合物沿浓度梯度逆向扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的,它是一种动态连续的取样方法［1］。近年来，它在药代动力学研究领域，尤其是在药物分布及代谢研究中有重要应用，发展速度极快。川芎嗪(tetramethylpyrazine，tmp)是中药川芎中的主要活性生物碱，磷酸川芎嗪(tetramethylpyrazinephosphate，tmpp)为其磷酸盐，临床上广泛用于缺血性脑血管病的治疗。作者拟采用微透析技术研究磷酸川芎嗪在体内的药动学行为，因此有必要测定tmpp体内回收率来评价其体内微透析采样的可行性，本试验采用微透析技术对磷酸川芎嗪在大鼠体内的回收率进行了相关研究，为进一步采用微透析技术探讨磷酸川芎嗪在体内的药动学行为提供实验依据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪:dionex summit p680 (dionex公司)，微透析设备(sweden cma公司)：微透析探针cma/12 microdialysis probe:膜外径0.5 mm，活性透析膜长度4 mm，分子量截留值为20kd；cma/20 microdialysis probe：膜直径0.5 mm,活性透析膜长度为10 mm,分子量截留值为20kd;灌注器推进泵(cma 402 syringe pump),灌注器(cma 1.0 ml exmire microsyringe，ms-gan100)。磷酸川芎嗪对照品购于中国药品生物制品检定所(批号：100845-200501)。sd大鼠（广州中医药大学实验动物中心，许可证号scxk粤2006-003）。色谱甲醇(dima公司)，水为纯水，其他试剂为分析纯。
2 方法
2.1 色谱条件色谱柱为phenomenex luna c18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为甲醇水（3∶2,v/v）;流速为1.0 ml·min-1;检测波长：295 nm;柱温室温；进样量20 μl。
2.2 空白林格氏液的配制分别称取氯化钠8.590 7 g，无水氯化钙0.255 3 g和氯化钾0.298 2 g溶解于蒸馏水中，定容至1 000 ml,用0.22 μm的水系微孔滤膜过滤,超声20 min脱气，即得林格氏液(ringer's液)。
2.3 标准曲线的制备精密称取五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的tmpp标准品3.93 mg置于100 ml量瓶中，ringer's溶液定容，振摇即得浓度为39.3 μg·ml-1的标准品贮备液。对标准品贮备液进行倍比稀释得质量浓度分别为0.131，0.393，0.786 ，1.179，1.572μg·ml-1标准品液，均进样20 μl,以标准品浓度(x)对峰面积（y）进行线性回归，得回归方程y= 0.257x-0.003 1，r= 0.999 8, tmpp在0.131～1.572 μg·ml-1范围内呈良好的线性关系，在该色谱条件下的最低检测限为5 ng·ml-1。
2.4 精密度考察取0.393，0.786和1.179 μg·ml-1的3种浓度标准品溶液分别在1 d内连续进样5次，进样20 μl/次，另分别在连续5 d内每天进样1次，进样20 μl/次，考察日内精密度和日间精密度，结果表明标准品液的日内精密度rsd分别为0.93%,0.73%和0.68%，日间精密度rsd分别为1.58%,1.25%和1.08%，表明精密度良好。
2.5 体内微透析试验
2.5.1 tmpp林格氏液的配制 分别精密称取tmpp适量，加林格氏液溶解定容，微孔滤膜过滤， 得tmpp浓度分别为0.142，0.710，1.42 μg·ml-1的林格氏液。
2.5.2 探针的植入雄性sd大鼠约300 g左右，腹腔注射20%乌拉坦麻醉,体温维持在37℃，在颈部开一个切口，分离右颈静脉，微透析探针cma/20用导引管植入右颈静脉，固定探针，然后大鼠移到脑部立体定位仪上，平行于矢状缝上做一中线切口，前囟作为定位脑部探针的基点，坐标为ap, + 0.2 mm, ml, -3.0 mm,dv, - 7.5 mm,用颅钻在相应位置钻一个直径1 mm左右的孔，脑部探针cma/12用立体定位仪支架缓慢植入，两只探针均以空白ringer's液2 μl·min-1灌注2 h平衡，之后收集空白样品3份，时间间隔15 min，作为阴性干扰试验样品, 在本试验所采用的色谱条件下，tmpp峰形良好，无杂峰干扰测定，具有较高的特异性，分析条件可行。相关色谱图见图1。
2.5.3 流速对回收率的影响灌流液的流速是影响探针回收率大小的重要因素之一。灌流液的流速越快，其流经半透膜时，膜内外药物的平衡时间就越短，导致回收率越低。在体内微透析试验中，由于探针外部组织液的药物浓度未知，一般可通过反透析法测定药物经过半透膜时的流失量来间接计算探针的体内回收率。
探针植入平衡后，用tmpp浓度为1.42 μg·ml-1的ringer's液在不同流速(1.5，2.0，2.5μl·min-1)下灌注探针。每种流速收集前均平衡1 h,共收集5份微透析液样品，每份30 μl，hplc法测定透析液中tmpp浓度(cdialysis)和灌注前ringer's液中tmpp浓度(cperfusate)，按公式rl=( cperfusate- cdialysis)/cperfusate×100％（公式1）计算tmpp的回收率。结果见表1。表1 不同流速下磷酸川芎嗪的体内回收率（略）
结果表明，随着流速的增加，tmpp体内回收率呈降低趋势，这为反透析法测定tmpp体内回收率提供了实验依据。
2.5.4 浓度对回收率的影响在体内微透析试验中，探针周围细胞外液中的药物浓度是可变的，为了保证透析液中药物浓度的变化能正确反映组织中药物浓度的变化，探针的回收率大小必须相对稳定，即探针的回收率与组织中药物的浓度无关，这是利用微透析技术测定细胞外液中药物真实浓度的理论前提。本实验利用反透析法考察浓度对回收率的影响。探针植入平衡后，用tmpp浓度分别为0.142,0.710,1.42 μg·ml-1的ringer's液以2.5 μl·min-1的流速灌注探针。每种浓度收集前均平衡1h,共收集5份微透析液样品，每份30 μl，hplc法测定透析液中tmpp浓度，按公式1计算回收率，结果见表2。表2 不同浓度磷酸川芎嗪的体内回收率（略）
结果显示，当以2.5 μl·min-1的流速灌注探针时，在3种不同tmpp浓度的透析媒体中，所得回收率很接近，表明在0.142～1.42 μg·ml-1浓度范围内，tmpp的回收率与浓度无关。
2.5.5 回收率的稳定性考察体内微透析试验持续的时间一般较长，同一根探针常常需要连续取样几个小时，如果在长时间的取样过程中回收率发生较大的变化，那就会失去微透析技术本身的意义。因此，有必要考察tmpp体内回收率的稳定性。
探针植入平衡后，用tmpp浓度为1.42 μg·ml-1的ringer's液以2.5 μl·min-1的流速灌注探针，每30 min收集1次透析液，灌流6 h。测定透析液中tmpp浓度，按公式1计算回收率，结果见图2。
结果表明，当灌流液流速为2.5μl·min-1时，tmpp体内回收率在6 h内基本保持稳定，脑微透析探针与血液微透析探针的体内平均回收率分别为17.89％和39.69%，rsd分别为9.16％和8.67% ，说明探针的体内回收率具有良好的稳定性。
4 讨论
微透析取样技术可以在许多活体组织及细胞外液中在体取样，在药物动力学及药效学研究中具有独特的优势。相对于其他生物取样技术，微透析技术具有以下几个方面的显著特点：①时间分辨性，可连续跟踪体内多种化合物量随时间的变化；②空间分辨性，取样无需匀浆过程，可真实代表取样位点目标化合物的浓度，同时在体内不同部位插入探针可研究目标化合物的体内分布;③提供不含蛋白质等大分子物质的游离态小分子化合物，对药物研究具有重要意义；④样品因不含蛋白质、酶等大分子物质，可不经预处理直接用于测定。此外，应用md技术研究药动学勿需采血即可从同一动物收集大量样本而不损失体液量，避免了传统研究方法中因采血后血容量减少所造成对药物分布及消除的影响，其时间分辨性可使药动学资料更准确［1,2］。
在微透析取样方法中，探针回收率是将微透析技术应用于药动学研究的一个关键问题，其大小受探针的性质(如有效膜的长度、膜孔大小等)、待测物的性质(脂溶性、蛋白结合率、分子大小等)、灌流液的组成(亲脂性、ph值等)、流速等诸多因素的影响［3］。探针回收率的测定主要有零净流量法、反向透析法、外推至零流速法等［1］，应用反向透析法校正微透析探针回收率的原理是探针的回收率和释放率相等，在两者相等的条件下，用药物自身的释放率校正相对回收率可以减少实验误差，是一种准确的校正方法。但是探针对药物的相对回收率和释放率是否相等取决于药物本身的性质，并非所有药物都可以应用，作者所在课题组已经对tmpp的体外回收率进行了相关研究［4］，结果证明探针对tmpp的体外回收率和释放率相等，因此，体内试验测定的微透析探针对tmpp的释放率即为探针的体内回收率。
由于tmpp在体内的半衰期较短，在回收率满足要求的前提下、应尽可能的提高时间分辨性，故本研究在体内试验中最终选择2.5 μl·min-1的流速，本文的研究结果为微透析技术用于tmpp的体内药动学研究提供了实验依据和方法支持。
【参考文献】
［1］n. plock,c. kloft. microdialysis theoretical background and recent implementation in applied life-sciences［j］.eur. j. pharm. sci,2005,25:1
［2］tsai th．assaying protein unbound drugs using microdialysis techniques［j］.j chromatog b，2003, 797:161
［3］只达石，黄慧玲．微透析技术系统在神经科学中的应用［j］.生物医学工程与临床，2005，9(1)：56
［4］晏亦林，叶勇,周莉玲,等.磷酸川芎嗪微透析体外回收率的研究［j］.中药新药与临床药理,2008,19(2):117.
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