目的 通过动物实验，观察S180瘤株对小鼠荷瘤形成的影响，探讨S180肉瘤细胞的致瘤机制。 方法 建立小鼠实体瘤模型，将昆明系小鼠36只，按体重随机分为3组，每组12只。空白组：每日灌胃给予蒸馏水，0.2 mL/10 g体重；模型组：皮下接种S180肉瘤细胞，制成小鼠实体瘤模型，其后每日口服灌胃1%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液；环磷酰胺组：皮下接种S180肉瘤细胞，制成小鼠实体瘤模型后，注射0.02 g/（kg·d）环磷酰胺注射液。观察各组肿瘤生长情况，计算平均重量；与模型组比较，环磷酰胺组计算肿瘤生长抑制率；采用蛋白免疫印迹法技术方法，检测抑癌基因P53、P21及凋亡抑制基因Bcl-2在S180肿瘤动物模型瘤体组织中的蛋白表达。 结果 模型组小鼠荷瘤成功，与空白组比较，模型组小鼠出现肿瘤，其瘤重为（1.513±0.790）g，环磷酰胺组瘤重为（0.248±0.253）g，两组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01），环磷酰胺抑瘤率为83.63%。在被检瘤体中，三种蛋白表达空白组与模型组、空白组与环磷酰胺组相比差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；与环磷酰胺组比较，模型组P53、P21抗体的蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），其中，P21表达差异有高度统计学意义（P < 0.01），而Bcl-2变化不大，差异无统计学意义（P=0.66）。 结论 S180肉瘤细胞可能通过抑制P53与P21的表达而起到促进肿瘤形成的作用，该机制的研究可为筛选肿瘤治疗药物及肿瘤机制探讨等的肿瘤动物模型提供重要的实验依据。
S180；蛋白免疫印迹法；P53；P21；Bcl-2
R730 A 1673-7210（2014）09（c）-0009-04
Effects and tumorigenic mechanism of S180 cell line in tumor-bearing mice model
CHI Shuping1 ZHANG Shilong1 CHEN Hongge1 LIU Jun1 DU Li1 SUN Jie1 JIANG ZhengJie2▲ CHENG Yun1▲
ment of Pharmacy Research Lab， 302 Hospital of PLA， Beijing 100039， China； and Epidemic Prevention Team， Air Force Logistics Department of PLA， Beijing 100005， China
Objective To investigate the tumorigenic mechanism of sarcoma cell line （S180） through observing the effects of S180 on bearing tumor formation in mice. Methods Establishment of solid tumor model in mice， 60 Kunming mice were randomly divided into negative control group， model group and positive control group （Cyclophosphamide group） according to the body weight， 12 mice in each group. The negative control group was given distilled water， 0.2 mL/10 g. Except for the negative control group， subcutaneous injection with S180 sarcomas cells was done in the mice of other two groups. After the tumor model of mice was established， the model group mice were lavaged daily with 1% sodium carboxymethyl cellulose solution， and Cyclophosphamide group mice were injected Cyclophosphamide， 0.02 g/（kg·d）. Then the tumor's volume and weight were measured， the tumor growth inhibition rate was calculated， and the expression of tissue protein of three kinds of antibody including tumor suppressor gene （P53 and P21） and apoptosis inhibiting gene （Bcl-2） were detected by Western blotting technology. Results The S180 cells planted tumor model of mice was established but not appearanced in negative control group. The tumor weight in model group and Cyclophosphamide group was （1.513±0.790） g and （0.248±0.253） g， respectively， it was significantly different （P < 0.01） between the two groups. The inhibitory rate of positive control group was 83.63%. Compared with positive control group， the P53， P21 and Bcl-2 protein levels were significantly different in the model group and Cyclophosphamide group （P < 0.01）. Compared with positive control group， the P53 and P21 protein level significantly decreased in model group （P < 0.05）， the difference of P21 was highly statistically significant （P < 0.01）， the changes of Bcl-2 were not statistically significant （P=0.66）. Conclusion The S180 sarcoma cells may promote tumor formation by inhibiting expression of P53 and P21. This mechanism can provide important experimental evidence for tumor animal model for screening drug and tumor mechanism.
S180； Western blotting； P53； P21； Bcl-2
肿瘤是当前危害人类健康最主要的疾病之一，恶性肿瘤更是威胁生命的杀手。人类医学在对抗肿瘤的战争中，做了大量的科学研究工作，其中最基本的就是肿瘤细胞模型与肿瘤动物模型的建立。Foley等在1956年建立了可移植性小鼠S180肿瘤细胞株，将其注入CFW小鼠腹腔内保种传代。自细胞系建立以来，被广泛用于筛选肿瘤治疗药物及肿瘤机制探讨研究，同时荷S180小鼠也成为最常用的肿瘤动物模型之一。由于S180瘤细胞株及其肿瘤动物模型在医学研究上具有重要的作用，因此，其在细胞内的作用机制亟待深入探究。本研究旨在通过建立肿瘤动物模型，观察肿瘤相关基因在肿瘤形成中的作用，以期在抗肿瘤动物模型研讨中减少和控制实验误差。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药物与试剂 环磷酰胺购自山西普德药业有限公司（批号20070310）；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo（批号JL128100）；RPMI1640培养基、胎牛血清均购自Gibco公司，发光试剂盒购自Thermo公司，P53、P21、Bcl-2多克隆抗体、二抗均购自Santa公司。
1.1.2 动物与瘤株 昆明种健康小鼠，清洁级（2级），雌雄各半，体重（20±2）g，由军事医学科学院实验动物中心 提供，合格证号为：scxk-（军）-2007-004；小鼠S180腹水瘤株为解放第三〇二医院药学部研究室保存。
1.1.3 仪器 酶联仪型号为ZS-3，由北京新风机电技术公司制造；电子天平型号为SPN202F，购自梅特勒-托利多常州称重设备系统有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠实体瘤模型的建立 取健康昆明系小鼠6只，雌雄各半，腹腔注射液体石蜡油0.5 mL/只，7 d后腹腔接种S180细胞，0.5 mL/只，9 d左右见小鼠腹部涨大，按之有波动感后，断颈处死，无菌条件下分别取出腹水，用RPMI1640培养基洗涤2次后制成细胞悬液。
1.2.2 实验小鼠分组和给药 取小鼠36只，按体重随机分为3组即空白组、模型组、环磷酰胺组，每组12只，6只/笼。除外空白组，小鼠右腋皮下接种S180细胞悬液，0.1 mL/只，制成小鼠实体瘤模型。空白组：每日口服灌胃生理盐水（NS），0.5 mL/只；模型组：接种肿瘤细胞后，每日口服灌胃1%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液，0.5 mL/只；环磷酰胺组：接种肿瘤细胞后，每日注射环磷酰胺注射液0.02 g/（kg·d），连续10 d，第11天测量小鼠体重并眼球取血，断颈处死后留取肿瘤组织，-80℃冻存备用。
1.2.3 小鼠实体瘤瘤体的获取 三组小鼠经10 d连续给药后，在末次给药之后的24 h，经测量全部小鼠的体重后颈椎脱臼处死并且解剖，分别剥离其瘤体，清除非肿瘤组织，称取重量，计算平均重量，计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率=（模型组平均瘤重-环磷酰胺组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。
1.2.4 组织蛋白的制备 每组小鼠各取4个肿瘤物混合后放入预冷的组织研磨器内，空白组选取部位为小鼠上肢部分肌肉。每个研磨器内加入裂解液500 μL，内含蛋白酶抑制剂（PMSF）2 μL，冰上研磨30 min后转入离心管中，静置10 min后12000 r/min低温离心15 min（4℃），吸取上清，以备蛋白含量检测。
1.2.5 蛋白质浓度测定 采用BCA法。将制备好的组织蛋白利用蛋白定量试剂盒进行含量检测。
1.2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）法 取50 μg蛋白加入等体积的蛋白变性液，煮沸10 min后，进行12%的SDS-PAGE电泳，然后电转至PVDF膜、封闭后，分别加入P53、P21、Bcl-2一抗，4℃过夜，TBST缓冲液洗膜后，加入HRP标记好相应的二抗，待洗膜后，用发光试剂盒ECL法在暗室中发光、曝光、显影、定影。具体方法参考文献。
1.2.7 图像分析 采用Alpha Ease FC 4.0软件进行光密度分析，以β-actin条带的平均光强度为内参照，结果以蛋白的相应水平与β-actin的比值表示。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肿瘤生长小鼠的一般情况
模型组肿瘤小鼠明显出现精神萎靡不振、食欲较差、畏寒群聚、扎堆、体毛稀疏且干涩、动作迟缓而懒动的情况，个别出现瘤皮破溃、腹水形成等生理的异常变化，并且有3只动物死亡；而环磷酰胺组小鼠的状况较模型组好，但极个别也有少毛和脱毛、精神萎靡、懒动等情况，有1只小鼠死亡。
2.2 S180肉瘤对小鼠肿瘤形成的影响
模型组小鼠在接种后出瘤现象早，发展快，在剥离瘤块时有不易剥离现象，有的质地软烂，有的分界不清，有的甚至粘连到锁骨和胸骨，说明模型组小鼠荷瘤成功。与空白组比较，模型组出现肿瘤，模型组肿瘤与环磷酰胺组比较，瘤重显著增大，两组差异有高度统计学意义（P < 0.01），环磷酰胺抑瘤率为83.63%。见表1。
表1 各组肿瘤组织情况（x±s）
注：与模型组比较，*P < 0.01；“-”表示无数据
2.3 肿瘤组织中各蛋白表达情况
空白组与模型组、空白组与环磷酰胺组比较，3种蛋白表达水平差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；与环磷酰胺组比较，模型组P53、P21表达量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），其中，P21表达差异有高度统计学意义（P < 0.01），而Bcl-2表达变化不大，差异无统计学意义（P=0.66）。见表2、图1。
表2 三组P53、P21、Bcl-2蛋白表达水平比较（x±s）
注：与空白组比较，②P < 0.01 ；与模型组比较，③P < 0.05，④P < 0.01
1.模型组；2.空白组；3.环磷酰胺组
图1 Western blot 法检测3种蛋白表达情况
3 讨论
肿瘤是危害人类健康的主要疾病，正日益受到人们关注。世界各国均对该类疾病的防治与研究进行了大量颇有成效的工作，取得显著进展。在临床上一般采用手术疗法、化学疗法和放射疗法治疗，但是到目前为止还没有一种方法可以彻底根治肿瘤。在针对肿瘤的致病机制和治疗研究中，S180瘤细胞株是常用的研究模型。许多研究表明，S180的致瘤性有时会消失，但是具体原因还不得而知。环磷酰胺在体内氧化生成中间产物醛磷酰胺（aldophosphamide），是通过肝细胞色素P450而完成的，磷酰胺氮芥（phosphamide mustard）从肿瘤细胞内被分解出来再与细胞的DNA发生烷化作用，形成交叉联结，从而抑制肿瘤细胞的生长繁殖。因此，其常被用于肿瘤研究中的阳性对照。
肿瘤的生长和转移是一个多步骤的复杂过程，其中涉及了大量的信号转导和凋亡基因。众所周知，迄今发现与人类肿瘤相关性最高最经典的基因是P53，亦称为抑癌基因，是人体的抑癌基因。经研究发现，在近50%的肿瘤患者当中存有P53基因缺失或突变，P53基因的失活对肿瘤形成起重要作用，而位于P53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子是P21基因。因P21和P53可以共同构成细胞周期G1检查站，DNA损伤后不经过修复则无法通过，所以减少了受损DNA的复制和积累，从而发挥其抑癌作用，说明正是通过P53-P21这条经典的信号通路而实现的。此外，Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，其调控细胞凋亡的功能主要是通过自身二聚体或与Bax等蛋白形成异二聚体来发挥，而促凋亡的功能可以通过Bax-Bcl-2异二聚体抵消Bcl-2-Bcl-2同二聚体 的抑凋亡作用来发挥。研究还发现在线粒体细胞色素C释放的上游发挥其抗凋亡作用的方法还可以通过阻止caspase的活化，如caspase-2等等。本研究显示，S180瘤株可能通过抑制P53及P21基因的表达而达到致瘤的目的。除此之外，对于S180致瘤性消失原理，也需要进行深入研究。
总之，本研究结果表明，S180瘤株在小鼠动物模型体内荷瘤作用稳定，实验重复性和致瘤率均可达到98%以上，明确了致瘤作用是通过降低抑癌基因P53和降低P21基因的表达，该肿瘤相关分子机制的研究发现，亦为环磷酰胺抗肿瘤动物模型作为阳性药物对照奠定了重要的理论依据。
Foley GE，Drolet BP. Sustained propagation of sarcoma of 180 in tissue culture . Proc Soc Exp Biol Med，1956，92（2）：347-52.
Foley GE，Drolet BP. Loss of neoplastic properties in vitro 1 observations with s-180 cell lines. Cancer Res，1964， 24（6）：1461-1467.
徐叔云.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1993：8119.
韩锐.抗癌药物研究与实验技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：297-298.
萨姆布鲁克，拉塞尔著，黄培堂，等.分子克隆实验指南.3版.北京：科学出版社，2002：1713-1726.
Vindelov LL，Christensen IJ，Nissen NI. A detergent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis . Cytometry，1983，3（5）：323-327.
Little SA，Mac A，Mirkes PE. Role of the cell cycle in cyclophosphamide（CP）induced teratogenesis .Teratology，1991，43（5）：421-422
贾春平.抑癌基因P53与肿瘤研究的最新进展.生命科学，2008，20（3）：450-453.
张艳，何凤田.p53基因在肿瘤基因治疗中的研究进展.世界华人消化杂志，2003，11（10）：1593-1596。
Kastan MB，Bartek J. Cell-cycle checkpoints and cancer .Nature，2004，432（7015）：316-323.
Massague J.G1 cell-cycle control and cancer .Nature，2004，432（7015）：298-306.
Olivier M，Hainaut P. TP53 mutation patterns in breast cancers：searching for clues of environmental carcinogenesis . Semin Cancer Biol，2001，11（8）：353-360.
Zamzami N，Brenner C，Marzo I，et al. Subcelluar and submitochondrial mode of action of Bcl-2-like oncoproteins . Oncogene，1998，16（2）：2265-2282
Burlacu A. Regulation of apoptosis by Bcl-2 family proteins . J Cell Mol Med，2003，7（5）：249-257.
中国论文网(www.lunwen.net.cn)免费学术期刊论文发表,目录,论文查重入口,本科毕业论文怎么写,职称论文范文,论文摘要,论文文献资料,毕业论文格式,论文检测降重服务。
