第1篇：探讨阻断mTOR信号通路抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的作用机制
目前，越来越多的证据显示肿瘤干细胞（，CSCs)会导致肿瘤复发和转移以及对放化疗不敏感，因此针对肿瘤干细胞的治疗是成功治愈肿瘤的关键。我们的前期研究发现在人原代鼻咽癌细胞中也存在类肿瘤干细胞，同时mTOR信号通路呈激活状态，用免疫组织化学双染技术证实这些异常活化的细胞中上皮干细胞标记物可选择性的共表达，并且用雷帕霉素可抑制鼻咽癌肿瘤细胞的增殖〔-2〕。因此我们可以假设鼻咽癌类肿瘤干细胞中雷帕霉素耙蛋白（mTOR)通路较鼻咽癌细胞异常激活，雷帕霉素可以通过下调mTOR信号通路下游活性蛋白的表达而抑制鼻咽癌类肿瘤干细胞的增殖。本研究采用无血清培养法富集类肿瘤干细胞，并鉴定其干细胞特性，验证mTOR信号通路在类肿瘤干细胞及鼻咽癌细胞中的表达差异，并观察雷帕霉素在抗类肿瘤干细胞中的作用，初步探讨阻断mTOR信号通路抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的作用机制。
1材料与方法
1.1材料细胞鼻咽癌细胞株CNE2由南方医科大学肿瘤研究所惠赠。
主要试剂胎牛血清、RPMI-1640培养液、培养液、B27C1：50)、均购自GIBCO公司，EGF、bFGF购自公司，mTOR、P-mTOR、P70S6、P-P70S6、4EBP1、、CD44、SOX2购自Cellsignaling公司，OCT4、Ramapycin购自Sigma公司，GAPDH购自公司，HRP标记的二抗为Biosharp公司，CCK8购自Dojindo公司。
主要试剂配制①含血清培养液：培养液45ml加胎牛血清5ml加青霉素100U/ml加链霉素100g/L，摇匀，冷藏备用；②无血清培养液：培养液49ml力口bFGF20啤/L力口EGF力卩B271ml摇匀，冷藏备用。
1.2实验方法细胞的普通培养复苏CNE2鼻咽癌细胞于含血清培养液中，37°C、5%CO2培养箱培养，至细胞处于对数生长期时，0.25%胰蛋白酶消化、传代。
鼻咽癌细胞类肿瘤干细胞的无血清富集培养取对数生长期普通培养之CNE2细胞，胰蛋白酶消化完全离心后，PBS洗涤2次，加入无血清培养液，调整细胞密度1X108/L于6孔板中，振荡，5%CO2、37°C饱和湿度培养。2d后半量换液，悬浮培养第5天后低数离心细胞悬液收集肿瘤球细胞。
鼻咽癌肿瘤球细胞的干细胞特性鉴定及mTOR信号通路的变化①CCK8法检测细胞增殖。将无血清培养收集的CNE2肿瘤球细胞及将对数生长期的贴壁CNE2细胞分别接种到96孔板中，每种细胞种6孔，每孔5000个细胞，每孔中加0.1ml含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37°C，5%CO2培养箱中培养。分别在培养的第1、3、5、7天向每孔加入10ul的CCK8溶液，继续孵育1h，用自动酶标仪（450nm波长）测吸收度数值，绘制2组细胞的生长曲线。
检测干细胞标记物蛋白和mTOR及其信号通路下游相关蛋白的表达。收集CNE2及肿瘤球细胞，用的PBS洗涤细胞3次，离心，弃上清，加入含10%磷酸酶抑制剂、1%PMSF的RIPA裂解液，超声裂解3次，冰上放置30min，4C、离心15min，收集分装上清液，BCA法测蛋白浓度。30ug蛋白上样，以10%的聚丙烯酰胺（SDS-FAGE)凝胶电泳分离蛋白后转至PVDF膜上，室温下由5%脱脂奶粉配制的封闭溶液中封闭2h，摇床均匀震荡，一抗CD44、SOX2、OCT4、mTOR、P-mTOR、P70S6、P-P70S6、4EBP1、均为1：500)4°C过夜，加入相应二抗(1：5000)室温摇床孵育2h，洗膜后以ECL试剂发光，检测目的蛋白条带，X-ray胶片曝光，结果用软件分析，以内参GAPDH表达情况作为内对照校正，目的蛋白相对表达量用目的条带值与内参比值表示，实验重复3次。
法测不同浓度雷帕霉素对鼻咽癌肿瘤球细胞及CNE2细胞抑制率的差异收集CNE2及肿瘤球细胞，分别用100ul含血清和无血清培养液接种于96孔板中，每孔5000个细胞，每孔中添加不同浓度雷帕霉素10ul，浓度梯度依次为：、0.110、10.0、100.0、1000.0nmol/L，每组设3个复孔，37°C，培养箱中培养，48h后加CCK8溶液10l继续孵育1h，用自动酶标仪(450nm波长）测吸收度值(A)，计算各细胞存活率（％)=(加药组A-空白组A)/(未加药组A-空白组A)X100%，计算2组细胞的半数抑制率浓度。
检测雷帕霉素作用肿瘤球细胞后mTOR及其信号通路下游相关蛋白的表达收集CNE2肿瘤球细胞1X106个，分别以0、20、50、100nmol/L不同浓度雷帕霉素作用，37°C，5%CO2培养箱中培养48h后，用Westernblot检测mTOR、P-mTOR、P70S6、P-P70S6、4EBP1、的表达，实验重复3次。
1.3统计学处理方法采用SPSS19.0统计软件处理分析数据，实验数据以尤士s表示，两样本均数比较采用f检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步多重比较采用LSI>(检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1鼻咽癌类肿瘤干细胞的培养与鉴定无血清培养及成球实验在无血清培养液中，CNE2鼻咽癌细胞开始呈现为悬浮状态，随时间推移，大部分细胞凋亡，少数活细胞晶莹透亮，呈圆形，边缘光滑无纤维伪足形成，悬浮生长并聚集成球，部分细胞逐渐沉于培养瓶底。2.1.2细胞增殖实验鼻咽癌肿瘤球细胞与CNE2在10%FBSRPMI-1640培养液中培养，在不同时间段各自细胞增殖情况以及A值的比较见表1。CCK8检测结果显示：在第1、天2组细胞的增殖无明显差异，在第5、天，肿瘤球细胞与CNE2相比，前者增殖更快，差异有统计学意义（P<0.05)。
干细胞标记物蛋白和mTOR及其信号通路下游相关蛋白的表达Westernblot检测结果显示，在CNE2细胞与成球细胞中，具有干细胞特性相关蛋白均有表达，相比较而言，在SOX2的表达方面，成球细胞较CNE2表达较高，差异有统计学意义（P<0.05)同样，在OCT4的表达上成球细胞较CNE2细胞表达较高（P<0.05)，而CD44在2组细胞中的表达差异无统计学意义（P>。见图2。
比较CNE2与鼻咽癌肿瘤球细胞（被认为是肿瘤干细胞CSCs)在mTOR及其信号通路下游相关蛋白的表达差异方面，Westernblot检测结果显示，在mTOR、P70S6、4EBP1的表达上，两者差异无统计学意义，而在各自活化的磷酸化水平的表达上，成球细胞较CNE2表达较高，均差异有统计学意义。2.1.4以0.1、1.0、10.0、100.0、浓度雷帕霉素对鼻咽癌肿瘤球细胞（认为是及CNE2细胞作用48h后，CCK8法测各自细胞存活数量，计算存活率，雷帕霉素对CNE2及CSCs的增殖均有抑制作用，并表现出一定的剂量依赖性，而比较两者的半数抑制率发现，CSCs的半数抑制率浓度为27.59nmol/L，而CNE2的半数抑制率浓度为78.12nmol/L，雷帕霉素对CSCs更加敏感。2.1.5雷帕霉素作用肿瘤球细胞后m丁OR及其信号通路下游相关蛋白的表达以0、20、50、浓度雷帕霉素作用肿瘤球细胞（认为是后，用Westernblot检测相关蛋白表达，以0组做对照，LSI>f检验结果显示，随着雷帕霉素浓度的递增，CSCs中mTOR及其信号通路下游蛋白P70S6、4EBP1的表达与对照组比较差异无统计学意义，而在其活化水平P-mTOR、P-P70S6、上的表达呈递减趋势，与对照组比较均差异有统计学意义（20nmo/L浓度时P-P70S6除外）。
3讨论
目前有不同方法来分选鼻咽癌肿瘤干细胞，如Wang等〔〕利用Hoechst33342从鼻咽癌细胞株中分选出具有干细胞特性的侧群细胞，体内外实验均表现出更强的致瘤能力；Zhuang等用免疫磁珠从鼻咽癌细胞中分选出具有干细胞特异性蛋白标志的CD133+细胞，并鉴定其具有干细胞特性，而根据干细胞可以在含EGF、bFGF无血清培养液中悬浮生长而不分化的特点，目前已报道乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、皮肤癌可以通过无血清培养干细胞球的方法来分离扩增出干细胞。因此我们通过无血清培养形成肿瘤球细胞的方法来富集鼻咽癌类肿瘤干细胞。本研究发现，与CNE2相比，成球细胞表现出更强的增殖特性，目前已知SOX2、OCT4作为干细胞标记物已广泛应用于干细胞的鉴定，我们用Westernblot检测，发现成球细胞在SOX2、OCT4上明显呈过度表达状态，因此我们有理由认为用无血清培养富集的鼻咽癌球细胞具有类肿瘤干细胞特性。
晡乳动物雷mTOR是细胞质中存在的一种丝(苏）氨酸蛋白激酶，其下游蛋白P70S6和4EBP1可调控基因转录、蛋白质翻译起始，因此处于细胞生长、增殖、存活中心调节者的地位。目前研究发现，在预后不良的乳腺癌、结肠癌、前列腺癌及卵巢癌等肿瘤细胞中，mTOR通路呈异常激活或过度表达，并表现出对放化疗不耐受的特性8。进一步的研究发现，在分选出的部分干细胞如结肠癌干细胞、多形性成胶质细胞瘤干细胞及神经干细胞中，mTOR信号通路也异常激活，其下游蛋白同样过度表达〔—11〕。我们前期的实验结果已表明，在人原代鼻咽癌肿瘤细胞中，mTOR信号通路呈激活状态[2〕。在此基础上我们进一步研究发现，与鼻咽癌细胞株CNE2相比，鼻咽癌肿瘤球细胞尽管在mTOR、P70S6、4EBP1表达上的差异不显着，但是其激活态的磷酸化水平（P-mTOR、P-P70S6、P-呈明显过表达状态，提示mTOR信号通路在鼻咽癌类肿瘤干细胞中同样异常激活。
雷帕霉素作为一种强有效的新型大环内酯类免疫抑制剂，其抗肿瘤作用被越来越多的研究者所认识，目前已知其对包括鼻咽癌在内如神经内分泌肿瘤、乳腺癌、小细胞肺癌、肝细胞癌等众多肿瘤均有抑制作用212〕。同时研究者通过体内及体外实验发现，联合其他药物或单独使用mTOR抑制剂可对神经胶质瘤干细胞〔3〕、骨肉瘤干细胞胰腺癌干细胞[15〕、肝癌干细胞〔6〕均有抑制作用。我们用不同浓度的雷帕霉素分别作用CNE2和肿瘤球细胞（即类肿瘤干细胞）后，测试2组细胞的存活率，比较其半数抑制率浓度发现，CNE2为，而肿瘤球细胞为27.59nmol/L，结果显示，雷帕霉素对鼻咽癌肿瘤干细胞具有更强抑制作用，并表现出良好的剂量依赖性。同时通过比较不同浓度雷帕霉素作用鼻咽癌肿瘤干细胞后mTOR信号通路上的蛋白表达，发现随着雷帕霉素浓度的提高，mTOR信号通路及下游蛋白的表达呈逐渐降低趋势，提示雷帕霉素可以通过抑制mTOR信号通路的活性来抑制肿瘤干细胞的增殖。目前以联合雷帕霉素及其他化疗药物作用肿瘤干细胞的报道居多。Zhu等〔7〕发现依维莫司（mTOR通路抑制剂）对乳腺癌干细胞有明显抑制作用，并且可提高曲妥单抗抑制乳腺癌干细胞增殖的敏感性，预防肿瘤的复发和转移。同时也有学者发现，在体外实验中单独使用雷帕霉素可明显抑制脑胶质瘤干细胞的增殖和致瘤能力，但是体内实验结果无法达到满意效果，其原因可能与肿瘤干细胞及其所处的微环境有关〔3〕。
综上所述，我们的实验进一步证明，通过无血清培养富集的鼻咽癌肿瘤球细胞具有干细胞特性，并且鼻咽癌类肿瘤干细胞中mTOR信号通路呈过度激活状态，雷帕霉素可通过抑制mTOR信号通路，达到抑制鼻咽癌肿瘤干细胞增殖的目的并具有一定的剂量依赖性。尽管本实验结果仅限于体外，体内实验效果有待进一步验证，但为雷帕霉素耙向治疗鼻咽癌肿瘤干细胞提供了一定理论依据。
作者：张宇1林刃舆2张子恒2陈健2杨春光3周磊2张悦2（1.湖北医药学院附属东风医院耳鼻咽喉头颈外科（湖北十堰，442000)；2.温州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科；3中南大学湘雅医学院附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科）
第2篇：鼻咽癌肿瘤的抗原研究
筛选人类肿瘤特异性抗原长期以来是困扰肿瘤免疫学界的一大难题，随着肿瘤免疫学理论和研究技术的发展，已有多种方法用于肿瘤抗原的筛选，如T细胞克隆技术[1]、血清学筛选重组cDNA表达文库（，技术、嗤菌体展示技术（phagedisplay)['核糖体展不技术（ribosomedisplay)⑷等。上述技术在研究相应的肿瘤相关抗原中已显示出一定的效果，但尚存一些不足之处。由于蛋白质组学技术近年来的发展，从蛋白质组水平筛选肿瘤抗原已陈现出其优势。
目前，有关鼻咽癌肿瘤抗原的研究仍然集中于研究EB病毒与鼻咽癌的相互关系上，而有关鼻咽癌细胞本身的肿瘤抗原研究到目前为止还几乎是空白[5?。因此，我们试图通过应用血清蛋白组学技术对鼻咽癌肿瘤抗原进行筛选，寻找一种筛选肿瘤抗原的便捷、灵敏的有效方法。
1材料与方法
1.1材料和仪器所有的鼻咽癌患者血清均取自四川大学华西医院经组织活检、病理切片确诊为鼻咽癌的初诊患者。正常血清为体检时所得正常人血清。人高分化鳞状上皮鼻咽癌细胞系CNE-1由河南医科大学惠赠。十二烷基磺酸钠（SDS)、甘氨酸（Glycine)、TriS、丙烯酰胺（、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、考马斯亮蓝G-250、蛋白定量试剂盒为BIO-RAD公司产品；二抗）购自Sigma公司；磁珠购自Dynal公司；显色剂购自VectorLaboratories公司；硝酸纤维素膜BioTraceNTMembrane购自PALL公司。电泳仪Mini-PROTEIN?3CELL、、GS"800标准扫描仪、凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品；质谱仪为德国Bruker公司产品。
1.2细胞培养与收集细胞在含有10%小牛血清、100jjig/ml青霉素、100Uig/ml链霉素的1640培养基中，于37T，5%C02饱和湿度的条件下培养。待细胞增殖至对数生长期时用生理盐水冲洗3遍，然后在冰浴条件下用细胞刮轻轻刮下，离心，弃上清，余留细胞团充分沥水后，置-80丈冰箱中保存待用。
1.3细胞蛋白质的提取将收集的细胞团（约1xlO7个细胞）重悬于10蛋白酶抑制剂Cocktail+1mlRIPA裂解缓冲液（150；l.0%NP^K)；0.5%脱氧胆酸钠；0?1%SDS；50mmol/LTris，pH8.0。使用前4丈预冷）中，并在冰浴条件下对细胞裂解物行超声裂解6次，每次10s，冰浴30min，15000r/min离心15min，收集上清，于-80T保存。
1.4免疫印迹技术筛选特异鼻咽癌血清将12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移的硝酸纤维素膜(NC膜)在室温下用含5%脱脂奶粉的，2.7mmol/LKC1，10mmol/LNa，HP04，2mmol/LBCH2P04，0.05%(v/v)Tween20，封闭211，？85洗3次，每次5111111。将~(：膜按电泳样品轨迹剪成条状，分别用不同彝咽癌患者的血清及正常血清（1：500稀释）在条件下孵育过夜，PBS洗3次，每次5min，然后加人碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(二抗，1：30〇〇〇稀释)室温孵育2h后，PBS洗5min，底物生色液显色。比较筛选出含有特异性抗体的病人血清。
1.5免疫沉淀筛选抗原取0.5ml细胞裂解液移人EP管中，加人筛选出来的彝咽癌血清2fxl，室温下于摇床上孵育2h。向EP管中各加人DynabeadsproteinA100pj，充分混匀，室温轻轻振荡孵育15min。用反复清洗3次，然后用洗脱抗原-抗体复合物，共2次。在洗脱样品中加入2xSDS凝胶加样缓冲液，样品置沸水中3~5min，15000r/min，离心5min。正常对照血清处理同上。将制备好的样品进行1-DSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，筛选差异条带。
1.6蛋白质鉴定及数据库査询切取差异蛋白条带，经胶内胰酶消化，采用公司）进行肽质量指纹图谱测定，获得的肽质量指纹图谱以酶自动降解峰进行校正，通过Mascot软件（Http：//)在蛋白数据库进行结果査询，査询条件：表观分子量的误差范围为±20%，肽片段分子量最大容许误差范围为±〇.2Da，每个肽允许有1个不完全裂解位点，物种来源选择人类，离子选择[M+H]+和，半胱氨酸为脲甲基半胱氨酸，被选择的片段信号峰均应较强，为基线宽度的1倍以上。
2结果
2.1筛选含有特异性抗体的彝咽癌患者血清经Westernblot比较正常血清与鼻咽癌患者血清以及不同鼻咽癌血清之间的免疫反应性差异，找出含有特异性抗体的彝咽癌患者血清。实验重复3次，重复性好。8号血清有明显区别与其它血清的反应性条带存在，表明8号血清中有特异性抗体存在。
2.2鼻咽癌相关肿瘤抗原的富集和筛选用筛选出来的血清捕捉鼻咽瘉肿瘤抗原，经免疫沉淀富集。3讨论筛选和鉴定新的肿瘤抗原对于寻找新的抗肿瘤疫苗、发现肿瘤早期诊断和判断预后的肿瘤标志等具有重要意义。筛选和鉴定抗体识别的肿瘤抗原正成为研究热点。目前，筛选抗体识别的肿瘤抗原的方法有血清学筛选重组cDNA表达文库（SEREX)、噬菌体展示技术(phagedisplay)、核糖体展示技术、肽库技术和蛋白质组学技术。T细胞克隆技术筛选肿瘤抗原，但该技术需要建立稳定的T细胞系和肿瘤细胞系的，而这种情况通常是难以遇到的，且对某些肿瘤类型来说又是不能做到的[11。噬菌体展示技术和核糖体展示技术需要构建和筛选抗体、抗体片段、单链抗体等各种类型抗体。（2)肿瘤中存在各种B细胞产生的IgGmRNA，它们在SEREX中能被表达和检测，因此，需要寻找去除这些克隆的策略和方法。
肿瘤血清蛋白组学是应用肿瘤免疫学和蛋白组学相结合的方法寻找肿瘤抗原。目前最常用的就是应用分离肿瘤组织蛋白和癌旁正常组织蛋白，经比较二维凝胶的蛋白分布，找出差异蛋白，通过质谱鉴定和生物信息学分析，筛选出肿瘤相关抗原[9]。我们本次实验在此基础上做了两点改进。首先，应用蛋白质印迹技术筛选具有特异免疫反应性的彝咽癌患者血清。肿瘤患者免疫水平较正常人为低，不能对肿瘤形成有效的识别及清除。但由于个体差异的影响，每个肿瘤患者对于肿瘤的免疫反应性也有所不同，因此在免疫水平较髙的患者血清中就有可能存在针对肿瘤产生的特异性抗体，用蛋白质印迹技术先筛选出这种血清，再利用血清中含有的特异性抗体筛选出特异性的肿瘤抗原，可提髙识别抗原的成功率。我们对所收集的34例彝咽癌血清进行了蛋白质印迹分析，其中8号及23号血清在相同位置出现了不同于其它血清样品的差异性反应条带，提示在这2个血清中可能存在鼻咽癌特异性抗体。另外有3个血清样品存在不同的差异性条带，应该为个体差异性的表现。其次，通过免疫沉淀技术富集肿瘤抗原。由于绝大多数肿瘤抗原在人体内的含量都非常少，所以不易被常规手段检出。而免疫沉淀技术通过将抗原聚集在惰性磁珠上，可以快速、简便地将抗原纯化1万倍，大大提髙了肿瘤抗原的检出率。应用这种方法，我们从鼻咽癌细胞株CNE1中筛选出了膜结合IgM，说明了通过蛋白质印迹筛选特异免疫反应性肿瘤患者血清，并利用免疫沉淀技术对肿瘤抗原进行纯化来筛选肿瘤特异性抗原是可行的。下一步工作我们将对膜结合IgM在彝咽癌的病理过程中所起的作用进行深入研究。
作者：宋鑫\杨金亮\唐小海2，柳斌1，秦慧\黄欣1，田聆\魏于全?四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，成都610041；2.成都市药友科技发展有限公司，成都）
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