摘要目的：通过回顾性病例分析，研究不规则抗体引起的新生儿溶血病（HDN）的血清学检测特点和抗体特异性分布。方法：选取2014年1月至2019年12月本院新生儿科送检的疑似HDN病例3047例，以本实验室检测证实为非ABO-HDN的病例为研究对象，同期检测标本中随机选取的ABO-HDN病例作为对照，分析致病抗体特异性、血清学检测特点、总胆红素变化趋势以及患儿性别构成比。结果：送检病例中67例确诊为非ABO-HDN患儿，其中男性患儿45例，阳性率1.48%；女性患儿22例，阳性率0.72%。65例患儿母亲有≥2次的妊娠史。检出的不规则抗体主要涉及Rh系统、MNS系统、Kidd系统和Lewis系统，其中Rh系统最多，抗体检出率88.07%。与ABO-HDN患儿相比，非ABO-HDN患儿的总胆红素水平发展较迅速，峰值较高（P<0.001），且持续时间较长。在血清学检测方面，非ABO-HDN直抗试验阳性率97.01%，高于ABO-HDN直抗试验阳性率47.00%（P<0.001）,且凝集强度常常≥2+，但仍存在直抗弱阳性或阴性的情况。结论：不规则抗体导致的非ABO-HDN大多发生在母亲有多次妊娠史的胎儿，且男性患儿多于女性患儿，检出的不规则抗体以Rh系统为主。与ABO-HDN患儿相比，非ABO-HDN患儿的胆红素峰值较高且持续时间长。直抗试验结果或能用于粗略区分ABO-HDN和非ABO-HDN。
关键词：新生儿溶血病；多次妊娠；微柱凝胶法；高胆红素血症；换血疗法；不规则抗体筛查
新生儿溶血病（hemolyticdiseaseofthenewborn，HDN）是指母婴血型不合所致新生儿同种免疫性溶血性疾病。根据发病原因分为ABO新生儿溶血病（ABO-HDN）及ABO以外不规则抗体引起的非ABO-HDN。在我国以ABO-HDN占多数（85.3%）[1]，患儿症状较轻；非ABO-HDN较少见，但患儿症状通常比较严重，除引起黄疸、贫血外，严重者可能出现水肿并引发核黄疸，造成脑损伤影响患儿智力，甚至导致患儿死亡[2]。本研究对2014-2019年确诊的非ABO-HDN患儿进行回顾性研究，进一步解析此类新生儿溶血病的特性，为临床产前产后检测、诊断和治疗提供依据。
资料和方法
研究对象
2014年1月至2019年12月本院新生儿科送检的疑似HDN病例3047例，以本实验室检测证实为非ABO-HDN的病例为研究对象，同期检测标本中随机选取的ABO-HDN病例作为对照。本试验经厦门大学附属第一医院伦理委员会批准。试剂与仪器低离子介质溶液和聚凝胺试剂购自中山市生科试剂仪器有限公司，抗-A、抗-B、抗-D、抗体筛选细胞、谱细胞、抗人球蛋白试剂、Rh分型试剂、MN分型试剂以及二巯基乙醇均购自上海血液生物医药有限责任公司。抗-Jka、抗-Jkb抗血清试验由荷兰Sanquie公司提供，抗-Mur抗血清、木瓜酶为自制试剂。以上试剂均检验合格并在有效期内使用。微柱凝胶卡专用恒温孵育器、微柱凝胶卡专用离心机购自西班牙戴安娜公司，抗人球蛋白微柱凝胶卡购自北京市斑珀斯技贸有限公司，KA2200离心机为日本久保田公司产品。
检测方法
采用试管法进行患儿和产妇ABO及Rh血型检测。先用微柱凝胶卡进行患儿直抗试验，将直抗凝集强度按0-4+进行分级，根据直抗的凝集强度，选择放散试验的方法，直抗阴性或凝集强度<2+，放散试验选择热放散方法，采用微柱凝胶技术进行ABO-HDN游离和放散试验；直抗阳性且凝集强度≥2+，放散试验选择酸放散方法。运用谱细胞检测患儿血清及红细胞放散液中的不规则抗体特异性，根据抗体特异性进一步检测患儿红细胞上相应抗原情况。若怀疑患儿为非ABO-HDN且合并ABO-HDN时，选择相应抗原阴性的A、B、O细胞进行游离、放散试验。所有HDN血清学操作均按照《全国临床检验操作规程》和试剂说明书进行[3]。诊断标准放散试验阳性或直抗、游离、放散3项试验中有两项阳性，可判为“可证实为HDN”；仅直抗试验或游离试验阳性，可判为“可疑HDN”。统计学分析选择SPSS22.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，数据比较采用独立样本t检验，分类资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
非ABO-HDN在男女患儿中的检出率3047例送检的疑似HDN患儿中，检出非ABO-HDN患儿67例，其中男性45例（占67.16%），阳性率1.48%；女性22例（占32.84%），阳性率0.72%。后续研究以67例非ABO-HDN患儿为研究对象，以同期检出并随机选取的200例ABO-HDN患儿作为对照进行。非ABO-HDN患儿的抗体特异性分布及构成比3047例送检的疑似HDN患儿中共检出不规则抗体67例，阳性率为2.20%。主要涉及Rh系统、MNS系统、Kidd系统和Lewis系统，分别为总抗体检出率的88.07%、7.46%、2.98%和1.49%。抗体的类型有抗-D、抗-E、抗-Ec、抗-M、抗-Lea和抗-Jka等，其中抗-D检出率最高（34例，占50.75%）（表1）。HDN血清总胆红素随日龄的变化趋势非ABO-HDN患儿与ABO-HDN患儿的总胆红素日均值随患儿日龄增长均先升高，后下降。非ABO-HDN患儿总胆红素峰值出现在第4天，均值（302.5±24.1）μmol/L，ABO-HDN患儿总胆红素峰值出现在第3天，均值（254.8±35.4）μmol/L，两组比较，差异有统计学意义（t=8.93，P<0.001）。非ABO-HDN患儿总胆红素水平发展较迅速，峰值较高，且持续时间较长（图1）。非ABO-HDN和ABO-HDN血清学试验不同结果组合构成比非ABO-HDN和ABO-HDN血清学试验结果组合的构成比见表2。从表2可计算出非ABO-HDN直抗试验阳性率占97.01%，其中直抗、放散阳性，游离阴性占19.40%，直抗、游离、放散皆阳性占77.61%。ABO-HDN直抗试验阳性率占47.00%，其中直抗、放散阳性，游离阴性占21.00%，直抗、游离、放散皆阳性占26.00%。非ABO-HDN直抗试验阳性率明显高于ABO-HDN（χ2=52.12，P<0.001）。
讨论
HDN发生的主要原因是胎儿和母亲血型不相容，胎儿红细胞进入母体，经免疫反应产生同种免疫抗体IgG，后者通过胎盘进入胎儿血液循环，致敏胎儿红细胞，致敏的红细胞被网状系统破坏，导致婴儿贫血、黄疽、水肿及肝脾肿大，溶血产生的大量未结合胆红素透过血脑屏障使脑神经核黄染，出现胆红素脑病，使患儿神经细胞和智力发育、运动功能等均受到损害[4]。在我国，ABO-HDN最为常见，Rh-HDN次之，其他血型系统如MNS、Duffy等引起的HDN少见[5]。非ABO-HDN大多发生在母亲有多次妊娠史的胎儿，但也有发生在第一胎的情况，这可能与“外祖母学说”有关[6]。本研究确诊的67例非ABO-HDN患儿中，有1例患儿母亲为首次妊娠且无输血史，1例患儿母亲有输血史，余65例均有≥2次的妊娠史，可见，反复多次血型不合的妊娠是胎儿发生HDN的高危因素之一[7]。对67例非ABO-HDN患儿进行性别统计，发现男性患儿数（67.16%）明显高于女性（32.84%），与何柏霖[8]报道的ABO-HDN中女性患儿高于男性患儿不同，原因有待进一步研究。从2014年1月至2019年12月，本实验室接收的3047例疑似HDN标本中，共检出非ABO-HDN67例，主要涉及Rh系统、MNS系统、Kidd系统和Lewis系统，其中Rh系统最多，占总抗体检出率的88.07%。Rh血型系统是目前确认的35个红细胞血型系统中最具多态性和复杂性的血型系统[9]，其中D抗原在我国汉族人群中阳性比例为99.7%，且免疫原性最强[10]，据报道，50%-70%的Rh（D）阴性的孕妇经妊娠途径受D抗原免疫刺激后产生抗-D抗体[11]。本次研究中抗-D（包括抗-D+G）共35例，占52.24%，抗-E次之，与文献报道结果类似[12]。而孕妇的不规则抗体筛查却是抗-E抗体多见[13]。这可能是因为抗-E抗体引起的HDN症状较抗-D抗体轻，存在临床漏送检的情况；同时由于检测阈值的影响，一些低效价的抗-E抗体容易被漏检。血清学检测作为HDN的诊断标准之一，包括直抗、游离、放散试验。本研究67例非ABO-HDN患儿中，除2例抗-M抗体、1例抗-Jka抗体以及2例抗-E抗体合并ABO-HDN直抗弱阳性，2例抗-M抗体直抗阴性外，其余直抗结果均强阳性（≥2+），而对照组200例ABO-HDN直抗结果均显示阴性或弱阳性（≤1+），提示直抗结果可能是粗略地区分ABO-HDN和非ABO-HDN的一个指标。值得注意的是，有4例抗-M抗体引起的HDN，其直抗结果为弱阳性甚至阴性，但患儿却出现黄疸、贫血等症状，其中1例患儿由于总胆红素高达369μmol/L而实施换血治疗。因此，对于直抗阴性或弱阳性的结果，要注意排除抗-M抗体引起的HDN。HDN的高胆红素血症是引起新生儿损伤的主要原因，且以未结合胆红素升高为主。笔者对67例非ABO-HDN患儿以及200例ABO-HDN患儿的胆红素日均值进行比较，结果显示，非ABO-HDN患儿胆红素发展较迅速，峰值较高，且持续时间较长，可见虽然非ABO-HDN发生率低，但是症状较重，对新生儿的危害较大。59例患儿经过蓝光照射退黄、丙种球蛋白注射封闭血清中抗体进而抑制溶血等治疗后，症状减轻；8例患儿胆红素较高，进行换血治疗。换血疗法可以最大程度降低血清中的胆红素，减少血清中的抗体和致敏红细胞，从而缩短病程[14]。非ABO-HDN发生率虽然远低于ABO-HDN，但是其引起的高胆红素血症严重危害患儿的健康，应引起临床的重视。建议加强输血科与产科、新生儿科的合作，将不规则抗体的筛查和鉴定纳入常规孕检项目；对于检出有临床意义的不规则抗体的孕妇，分娩后要尽早检测胎儿的红细胞是否被母体的不规则抗体致敏，做到早发现、早治疗，以减轻患儿的症状和并发症的发生；同时积极尝试改进实验方法，用不规则抗体筛查细胞替代常规HDN游离、放散试验中的O型红细胞用于检测，避免非ABO-HDN的漏检。
参考文献
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作者：郑艳玲 洪强 王前明 单位：厦门大学附属第一医院1输血科
