摘要目的：建立杞菊地黄丸的ＨＰＬＣ指纹图谱，为评价其质量提供依据。方法：色谱柱：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ⁃３（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相：乙腈⁃０．３％磷酸溶液，梯度洗脱；体积流量：０．６ｍｌ·ｍｉｎ－１；检测波长：２５４ｎｍ；柱温：４０℃；进样量：１０μｌ。建立杞菊地黄丸的指纹图谱，根据相似度评价，结合化学计量学方法对杞菊地黄丸进行质量评价。结果：建立２５批杞菊地黄丸的ＨＰＬＣ指纹图谱，共确定２６个共有指纹峰，通过与对照品比对指认了８个成分；２５批样品指纹图谱相似度为０．７３１～０．９８１，通过聚类分析（ＣＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、偏最小二乘法⁃判别分析（ＰＬＳ⁃ＤＡ），２５批样品分成４类，分类结果与厂家呈相关性，并发现１６个差异性标记物。结论：所建立的ＨＰＬＣ指纹图谱方法重复性好、专属性强，可为杞菊地黄丸的质量控制提供依据和参考。
关键词：杞菊地黄丸；高效液相指纹图谱；相似度评价；聚类分析；主成分分析；偏最小二乘法⁃判别分析
杞菊地黄丸由枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻等八味中药组成，现收载于中国药典２０２０年版一部，可用于治疗肝肾不足、阴虚阳浮、头晕耳鸣、羞明流泪、视物昏花等症状［１］。临床应用方面主要用于治疗高血压、高血脂、干眼症、慢性结肠炎、早期老年黄斑变性、脑震荡后遗症等［２～５］。目前关于杞菊地黄丸的质量标准研究更多地是关于莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量测定［６～８］，其他成分研究报道较少。中药复方制剂是多成分协同发挥治疗作用，仅检测单一或几个成分含量不能充分、全面、客观的评价其内在质量。中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与含量，进而对药品质量进行整体描述和评价，可应用于质量一致性评价、真伪鉴别等方面。指纹图谱即可定性鉴别使用，还可体现量的大小，包含的信息量大且多维［９，１０］。为了快速、全面的解析数据，指纹图谱数据分析常结合聚类分析、主成分分析及偏最小二乘法⁃判别分析等化学模式识别技术进行［１１］。本研究建立杞菊地黄丸的ＨＰＬＣ指纹图谱并进行相似度评价，同时结合化学模式识别方法对谱图进行全面分析，为全面评价杞菊地黄丸质量提供依据。
１仪器与试药
Ｗａｔｅｒｓｅ２６９５高效液相色谱仪（美国Ｗａｔｅｒｓ公司）；ＣＰＡ２２５Ｄ电子天平（德国赛多利斯公司）；Ｅｌ⁃ｍａｓｏｎｉｃＰ超声波清洗仪（德国Ｅｌｍａ公司）；水浴锅（天津泰斯特）莫诺苷对照品（批号：１１１９９８⁃２０１６０２，含量以９６．３％计）、马钱苷对照品（批号：１１１６４０⁃２０１７０７，含量以９９．２％计）、丹皮酚对照品（批号：１１０７０８⁃２０１４０７，含量以１００％计）、绿原酸对照品（批号：１１０７５３⁃２０１７１６，含量以９９．３％计）、木犀草苷对照品（批号：１１１７２０⁃２０１４０８，含量以９４．９％计）、３，５⁃Ｏ⁃二咖啡酰基奎宁酸对照品（批号：１１１７８２⁃２０１７０６，含量以９７．３％计）、木犀草素（批号：１１１５２０⁃２００５０４）对照品购自中国食品药品检定研究院；４，５⁃Ｏ⁃二咖啡酰基奎宁酸（批号：Ｅ⁃０４５１⁃１９０１０５３１，含量以９８．０％计）购自上海同田生物技术股份有限公司；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，液相用水为超纯水。杞菊地黄丸（大蜜丸）来源于１０个厂家共２５批样品，编号Ｓ１～Ｓ１２（Ａ厂家，批号：１５０１０２５３、１６０１２２６４、１６０１３１０２、１６０１３１０６、１６０１３１０７、１６０１３３１１、１６０１３３１３、１６０１３３１４、１７０１０７７３、１７０１０７７４、１７０１０７７９、１７０１０７８１）；编号Ｓ１３（Ｂ厂家，批号：１７１０００７）；编号Ｓ１４～Ｓ１６（Ｃ厂家，批号：１６１１０１、１７０４０１、１７１１０１）；编号Ｓ１７（Ｄ厂家，批号：２０１６１１０１）；编号Ｓ１８～Ｓ２０（Ｅ厂家，批号：５４８００７２、５４８００７４、５４８００７５）；编号Ｓ２１（Ｆ厂家，批号：１１５４９５）；编号Ｓ２２（Ｇ厂家，批号：１７０４０２６）；编号Ｓ２３（Ｈ厂家，批号：１６０６１１６）；编号Ｓ２４（Ｉ厂家，批号：Ａ１７００８）；编号Ｓ２５（Ｊ厂家，批号：１１１７０９２６）。
２方法与结果
２．１色谱条件
色谱柱：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ⁃３（４．６×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相：乙腈（Ａ）⁃０．３％磷酸溶液（Ｂ）梯度洗脱（０～１００ｍｉｎ，１％→３５％Ａ）；流速：０．６ｍｌ·ｍｉｎ－１；检测波长：２５４ｎｍ；柱温：４０℃；进样量１０μｌ。
２．２溶液的制备
２．２．１对照品溶液精密称取莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、３，５⁃Ｏ⁃二咖啡酰基奎宁酸、４，５⁃Ｏ⁃二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素各对照品适量，加７０％的甲醇制成浓度分别为２３８．６３，１３１．８２，３８５．１３，１９．８２，１３．６８，８８．３２，９．３６，２０．５１μｇ·ｍｌ－１的对照品混合溶液作为对照品溶液。２．２．２供试品溶液取剪碎的大蜜丸约２ｇ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入７５％乙醇２５ｍｌ，密封，称定重量，加热回流１ｈ，放冷，再称定重量，用７５％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，既得。２．２．３单味药材供试品溶液按照样品处方和工艺，分别取适量枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻，按“２．２．２”项下供试品溶液制备方法制备单味药材溶液。
２．３方法学考察
２．３．１精密度试验取杞菊地黄丸供试品（编号：Ｓ９）按“２．２．２”项下方法制备供试品溶液，在“２．１”色谱条件下连续测定６次，记录色谱图。结果，以马钱苷峰为参照峰，２６个共有峰相对保留时间及相对峰面积ＲＳＤ为分别小于０．１３％和２．６％（ｎ＝６），将６次采集的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统（２０１２．１版本）”，以精密度１为参照图谱，６次采集的图谱与生成的对照图谱相似度均大于０．９９２，表明仪器精密度良好。２．３．２重复性试验取杞菊地黄丸供试品（编号：Ｓ９）按“２．２．２”项下方法制备供试品溶液６份，在“２．１”色谱条件进行测定，记录色谱图。结果，以马钱苷峰为参照峰，２６个共有峰相对保留时间及相对峰面积ＲＳＤ为分别小于０．１８％和３．５％（ｎ＝６），将６次采集的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统（２０１２．１版本）”，以重复性１为参照图谱，６次采集的图谱与生成的对照图谱相似度均为１，表明该方法重复性良好。２．３．３稳定性试验取“２．３．１”项下供试品溶液，在“２．１”色谱条件下于０，２，８，１２，２４ｈ进样测定，结果，以马钱苷峰为参照峰，２６个共有峰相对保留时间及相对峰面积ＲＳＤ为分别小于０．５８％和３．３％（ｎ＝５），将５次采集的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统（２０１２．１版本）”，以稳定性０ｈ色谱图为参照图谱，４次采集的图谱与生成的对照图谱相似度均大于０．９９５，表明溶液在２４ｈ内稳定性良好。
２．４共有峰的归属及化学成分的指认取
“２．２”项下对照品溶液、供试品溶液、单味药材供试品溶液，按“２．１”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，结果见图１～图３，由对照图谱共指认８个特征峰，分别为峰５莫诺苷、峰７绿原酸、峰９马钱苷、峰１５木犀草苷、峰１７３，５⁃Ｏ⁃二咖啡酰基奎宁酸、峰１８４，５⁃Ｏ⁃二咖啡酰基奎宁酸、峰２３木犀草素、峰２６丹皮酚。由单味药材色谱图比对可知，峰１，２，５，８，９，１０归属酒萸肉；峰２，３归属熟地黄；峰１，４，６，８，１１，１３，１５，１６，２４，２６归属牡丹皮；峰７，８，１２，１４，１５，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４归属菊花；峰２５归属山药。
２．５指纹图谱的建立及相似度的评价
［１２］分别取２５批供试品，按“２．３”项下方法制备供试品溶液，在“２．１”色谱条件进行测定，记录色谱图。采用“中药指纹图谱相似度评价系统（２０１２．１版本）”，以Ｓ１号样品的色谱图为参照图谱，时间窗宽度０．２ｍｉｎ、中位数法、多点校正、全谱峰匹配，共标定２６个共有峰；计算相似度，得到２５批样品及对照指纹图谱的叠加图及相似度结果，见图４和表１。２５批样品相似度结果为０．７３１～０．９８１，其中Ｓ１３、Ｓ１７、Ｓ２２、Ｓ２４相似度较差，均低于０．９０；其他厂家多个批次相似度结果在０．９２２～０．９８１之间，相似度较好。
２．６化学模式识别分析
［１３］２．６．１聚类分析（ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ，ＣＡ）以２５批杞菊地黄丸的２６个共有峰面积为变量，将数据导入ＳＰＳＳ２６．０软件，采用组间连接，平方欧式距离进行聚类分析。由图５可知，类间距离为５时２５批样品分为４类，Ｓ１３（Ｂ厂家）一类、Ｓ１７（Ｄ厂家）一类、Ｓ２４（Ｉ厂家）一类、其他厂家一类。聚类趋势表明大部分厂家批次的样品质量趋于一致，但个别厂家样品有差异性。２．６．２主成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉＰＣＡ）将２５批样品的２６个共有峰面积数据导入Ｓｉｍｃａ⁃Ｐ１４．１软件，以２６个共有峰面积值作为变量，进行主成分分析，观察样品的自然聚集，ＰＣＡ得分图见图６。由图６可看出，Ｓ１３、Ｓ１７、Ｓ２２、Ｓ２４样品与其他样品分散，其他厂家样品聚集性明显，这一结果与相似度评价及聚类分析结果一致。２．６．３偏最小二乘法⁃判别分析（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔａｎａｌｓｉｓｏｆｐａｒｔｉａｌｌｅａｓｔｓｑｕａｒｅｓ，ＰＬＳ⁃ＤＡ）ＣＡ和ＰＣＡ分析仅能对样品进行分类，无法分析２５批样品间存在差异的原因，为分析引起组间差异的差异标志物，本实验将２５批样品共有峰面积值导入Ｓｉｍｃａ⁃Ｐ１４．１软件，通过ＰＬＳ⁃ＤＡ分析生成变量重要性投影值图（ＶＩＰ图），ＶＩＰ可直观体现各化合物引起组间差异的权重大小，化合物ＶＩＰ值大于１说明对样品分类结果权重影响率大于５０％，即对分类结果影响具有统计学意义，为差异标志物［１０～１４］。通过ＰＬＳ⁃ＤＡ分析，得到差异标志物（ＶＩＰ＞１）共１６个，分别为峰８、１３、６、１７、３、７、２４、１６、２、１０、１、４、１８、２６、１２、２１。涉及了能检出成分的四个单味药材。
３讨论
３．１供试品溶液制备方法摸索
本试验对比了不同的提取溶剂（５０％甲醇、５０％乙醇、７０％甲醇、７５％乙醇、９５％乙醇、纯甲醇）、提取方法（超声提取、加热回流提取）、提取时间（３０，４５，６０，７５ｍｉｎ）对杞菊地黄丸色谱峰数量及响应值的影响。最终确定制备方法为７５％乙醇醇加热回流提取１ｈ。
３．２流动相选择及优化
本试验对比了不同种类的流动相，首先对比了乙腈、甲醇与酸液，甲醇分析时间长且峰型和分离度较差，因此有机相选择了乙腈。后又对比了不同浓度的乙腈⁃磷酸、乙腈⁃冰醋酸溶液、不同的洗脱程序和不同的流速结果乙腈⁃０．３％磷酸溶液，梯度洗脱色谱峰数量多，峰型和分离度较好。因此最终确定，以乙腈⁃０．３％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱。
３．３检测波长的选择
本试验采用了全波长扫描测定了杞菊地黄丸样品，结果在２５４ｎｍ下供试品溶液色谱峰信息丰富，色谱峰分离度较好，因此采用２５４ｎｍ作为杞菊地黄丸指纹图谱的检测波长。
３．４结果分析
本研究共分析了１０个厂家２５批样品，２５批样品相似度结果为０．７３１～０．９８１，其中Ｓ１３（Ｂ厂家）、Ｓ１７（Ｄ厂家）、Ｓ２４（Ｉ厂家）、Ｓ２２（Ｇ厂家）四个厂家样品相似度小于０．９０；Ｓ１～Ｓ１２（Ａ厂家）相似度结果为０．９４２～０．９８１，Ｓ１４～Ｓ１６（Ｃ厂家）相似度结果为０．９２２～０．９７８、Ｓ１８～Ｓ２０（Ｅ厂家）相似度结果为０．９３４～０．９７４。由相似度结果看出，同一厂家相似度结果较好，且大部分厂家样品相似度结果差别不大，个别厂家差异较大。通过聚类分析、主成分分析结果可以看出Ｓ１３、Ｓ１７、Ｓ２２、Ｓ２４与其他样品差异较大，这与相似度评价结果一致。为了找出差异标志物，对２５批样品进行了ＰＬＳ⁃ＤＡ分析，找出影响样品组间差异标志物１６个，这１６个成分涉及酒萸肉、熟地黄、菊花、牡丹皮，说明其质量差异影响因素与处方中各单位药材均相关。
３．５小结
本研究建立了２５批杞菊地黄丸ＨＰＬＣ指纹图谱，进行了相似度评价，２５批样品的相似度为０．７３１～０．９８１。确定了２６个共有指纹峰，结合化学对照品指认出８个化合物，分别为莫诺苷、绿原酸、马钱苷、木犀草苷、３，５⁃Ｏ⁃二咖啡酰基奎宁酸、４，５⁃Ｏ⁃二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、丹皮酚；并对２５批样品进行了聚类分析、主成分分析及偏最小二乘法⁃判别分析，找出了差异样品４批和差异标志物１６个。该方法简单、专属性强，可为杞菊地黄丸质量控制提供参考。
作者：王小芳 郑倩倩 路丽娟 单位：石家庄市食品药品检验中心
