作者：罗盛旭，李金英，胡广林，贾振亚
【摘要】 目的分析砂仁中微量元素的溶出特性及形态，探讨微量元素的生物活性。方法采用电感耦合等离子体质谱（icp-ms）测定砂仁中13种元素含量及溶出率，分别用0.45 μm滤膜，正辛醇-水萃取体系，将砂仁水煎液中元素区分为可溶态与悬浮态、醇溶态与水溶态，并分析各形态。结果所建立的分析方法，标准曲线的相关系数为0.999 8～1.000 0, rsd为0.1%～5.0%，测定标准物质灌木枝叶中元素含量与参考值有良好的一致性。砂仁中co溶出率最高，各元素溶出率并非按照元素在药材中总量高低排序。砂仁的元素溶出以悬浮态居多，仅cr的可溶态/总溶出大于50%。水煎液中 fe、mo和cd的kow参数在胃、肠液酸度下均大于1，而cr、 ni的kow参数均小于1，元素的kow值受ph影响。结论砂仁中微量元素的溶出特性及形态，与砂仁的生物活性与功效具有一定关系。
【关键词】 砂仁； 微量元素； 溶出特性； 形态分析； 电感耦合等离子体质谱
abstract：objectiveto analyze the dissolution characteristics and speciation of trace elements in amomum villosum and investigate the bioactivity of trace elements. methodsthe content and dissolved rate of 13 trace elements in amomum villosum were analyzed by icp-ms with 0.45 μm membrane , the n-c8h17oh -water extraction system d the decoction of amomum villosum into several species, including the soluble species, suspended species or the n-c8h17oh-soluble species and water-soluble species, and studied every species. resultsthe correlative coefficients of the analytical calibration curves were 0.999 8～1.000 0,and rsd was 0.1%～5.0%. the accuracy and precision of the method were tested by comparing the values obtained from the determination of the standard sample, bush twigs and leaves（gbw07603）by this method with the reference values of gbw07603. the determination results were found to be basically consistent with the reference highest dissolved rate was co in the decoction of amomum villosum, the dissolved rate of element did not depend on the content of trace element in the drug. the trace elements of amomum villosum mainly existed in suspended species. only cr,its content in soluble species was more than 50% of its whole content in all species, and the kow values of fe, mo, and cd were all more than 1 under the ph of intestinal and stomach juice,while cr, ni were less than 1. kow values of trace elements was influenced by different ph values. conclusionthe dissolution characteristics and speciation of trace elements in amomum villosum,is related with the bioactivity and efficacy of amomum villosum to some extent.
key words：amomum villosum; trace elements; dissolution characteristics; speciation analysis; icp-ms
砂仁是姜科植物阳春砂、海南砂或绿壳砂的干燥成熟果实。WwW.lunwen.net.cn砂仁性辛、温,归脾、胃经,有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效。近年来对砂仁的化学成分和药理活性方面的研究已开展了许多工作，但对微量元素报道很少［1］。同时,微量元素的存在形态与其药理作用密切相关,在不同生理环境下,它具有不同的亲脂性和生理活性,从而表现出不同的药效［2］。因此，本文以海南砂仁为材料，测定了多种微量元素含量及水煎溶出率，阐明其溶出特性，并以0.45 μm滤膜区分水煎液中元素为可溶态和悬浮态，采用正辛醇-水萃取体系模拟中药水煎液在人体胃、肠中的分配，区分元素为正辛醇溶态和水溶态，测定kow参数及酸度的影响，以评价元素的亲脂性及生物活性［2］，以期为深入探讨砂仁中微量元素的药理作用机制提供参考。
1 材料与仪器
1.1 药材与试剂
海南砂仁，由海南省复康大药房提供。灌木枝叶标准物质（gbw07603）,购自地质矿产部地球物理地球化学勘查研究所。0.45 μm滤膜，上海市新亚净化器件厂。1 000 μg·ml-1多元素混合标准溶液，美国热电公司；浓硝酸、过氧化氢（30%）均为优级纯，正辛醇、氨水均为分析纯，实验用水为亚沸蒸馏水。
1.2 仪器与icp-ms
工作参数 x series 型电感耦合等离子体质谱仪（美国热电公司）； mrg-70分装式高压密封消化罐（沈阳森华理化仪器研究所）；dl-5-b离心机（上海安亭科学仪器厂）。icp-ms工作参数见表1。
表1 icp-ms的工作参数（略）
2 方法
2.1 砂仁药材处理及其微量元素含量的测定
砂仁药材用水冲净晾干，置烘箱中于60℃下烘24 h；取适量烘干药材，用玛瑙研钵磨碎，过14目筛；准确称量样品0.500 0 g，置ptfe消化罐中，加5 ml浓硝酸，盖好于室温下预消化24 h，挥尽棕色气体，加5 ml双氧水，组装好高压密封消化罐，置烘箱中于150℃消化4 h，得澄清透明消化液，以3%硝酸定容至50.00 ml待测；按icp-ms工作参数，以标准曲线法测定元素含量。
2.2 砂仁水煎液的制备及测定
准确称取14目砂仁样品30 g置烧杯中，按药材与水比例为1∶10加入亚沸水浸泡1 h，用电炉于220 v加热至沸，改用约75 v保持微沸状态1 h，稍冷转移到250 ml离心管中高速离心5 min，分离得首煎液，所余药渣再以亚沸水按上述方法制得2，3次煎液，将3次煎液混合定容至500.00 ml备用。取水煎液5 ml置ptfe消化罐中，加入5 ml浓硝酸和5 ml双氧水，组装好高压密封消化罐，置烘箱中升温到150℃，并保持3 h，消化完毕用3%硝酸定容至50.00 ml，用icp-ms法测定元素含量。
2.3 可溶态与悬浮态的分离及测定
水煎液经0.45 μm滤膜(用1 mol·l-1hno3浸泡过)抽滤,即得可溶态，将可溶态加热浓缩并用亚沸水定容到100.00 ml，取5 ml按“2.2”消化, 用3%硝酸定容至50.00 ml，用icp-ms法测定，扣除滤膜空白，得到可溶态元素含量，水煎液中元素总量与可溶态含量之差视为悬浮态含量。
2.4 正辛醇-水分配体系模拟实验 取水煎液2组，用氨水和硝酸调节ph值，一组调为胃液酸度（ ph=1.3 )，另一组调为小肠液酸度（ph=7.60），于37℃放置过夜,移入分液漏斗中,每份均加入正辛醇5.0 ml,振荡萃取2 h,重复3次,合并3次萃取的水相和醇相。水相按“2.2”方法消化，定容至50.00 ml，用icp-ms法测定，扣除空白即得到水相中元素浓度cw，差减法算出醇相中元素浓度 c0，据此计算元素在醇相与水相中的分布参数kow= c0/cw。
3 结果
3.1 砂仁中微量元素的分布及溶出特性砂仁及其水煎液中元素的含量、水煎溶出率见表2。表2 砂仁中微量元素的含量和水煎溶出率（略）
3.2 水煎液中微量元素可溶态与悬浮态的分布水煎液中11种元素的可溶态、悬浮态及相关数据见表3。表3 砂仁水煎液中可溶态和悬浮态的分布（略）
3.3 水煎液中微量元素醇溶态与水溶态的分布正辛醇的结构与人体内的碳水化合物和脂肪类似，药理上常以正辛醇-水萃取体系测定药物的kow参数以评价药物的亲脂性及生物活性。实验测得胃、肠液酸度下砂仁水煎液在正辛醇-水萃取体系中醇溶态、水溶态元素含量及kow参数。结果见表4。表4 砂仁水煎液在正辛醇-水萃取体系中醇溶态、水溶态元素含量和kow（略）
3.4 分析方法的精密度与准确度采用icp-ms法，标准曲线的线性相关系数为0.999 8～1.000 0。该法测定砂仁中微量元素含量的rsd为0.1%～5.0%。结果见表5。测定标准物质灌木枝叶（gbw07603）中元素含量，除镉外（镉标准值非确定值），回收率在84.9%～123.3%之间。结果见表6。表5 砂仁中元素含量测定的相对标准偏差rsd（略）表6 标准物质灌木枝叶中元素含量和回收率（略）
4 讨论
砂仁富含mn、fe，也含较多的zn、cu，且mn（387.87 μg·g-1）＞fe（193.57 μg·g-1）＞zn（51.360 μg·g-1）＞cu（8.840 μg·g-1），它们都是重要的生命元素。同时砂仁还含有cr、ni、co、mo、se、sn等有益元素，含量范围为2.210～0.119 μg·g-1。有害元素pb、as、cd的含量分别为2.210 μg·g-1、0.786 μg·g-1、0.018 μg·g-1，其含量均没有超过我国商务部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》（wm2-2001）规定的限量指标（pb≤5.0 μg·g-1、as≤2.0 μg·g-1、cd≤0.3 μg·g-1）。因此，海南产砂仁pb、as、cd没有超标，且含有多种重要生命元素和有益元素。
从溶出率来看，砂仁中co的最高（93.3%），cu的最低（18.9%）,富含的mn、fe溶出率中等，有害元素溶出率靠后，溶出率由高到低的顺序为co＞zn＞se＞cr＞mn＞cd＞ni＞fe＞mo＞as＞cu。可见，砂仁中元素的溶出率并非按照元素在药材中总量的高低排序，其溶出特性主要与元素在药材中存在的化学与物理形态相关。砂仁中co溶出率高，是否预示co具有较强的生物利用性，尚有待深入研究。但动物缺乏co，会表现出食欲减退、体质衰弱、易疲劳，晚期发生不孕、腹泻和流产等［3］，这跟砂仁具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效具有某种程度的一致性。由于中药服用方式是水煎液，微量元素溶出率理应是其生物利用性的重要指标。况且微量元素的溶出并非孤立，往往伴随有效成分（如活性金属有机物或配合物）的溶出，因此元素溶出率高低一定程度上也反映有效成分溶出的高低，若与中药临床疗效相结合以指导用药，可以赋予中药水煎剂一定的科学数据。
砂仁元素溶出以悬浮态居多，仅cr的可溶态/总溶出大于50%，这表明砂仁的元素可能主要以有机大分子结合态（如ni、se）、胶体态（如fe）或吸附性强的无机酸根离子态（如钼酸根）等被煎出，并在水煎液中聚集成较大颗粒，成为悬浮态。可溶态与悬浮态相比，前者可能以自由离子的形式或与某种低分子量配体结合的形式存在，颗粒小而易通过滤膜，较容易被人体吸收。砂仁水煎液中的cr以可溶态居多，zn、mn和co的可溶态也相对较多，它们的生物利用性可能是砂仁药理作用的重要组成部分。煎出元素形态的聚集性可能是形成悬浮态的重要因素，从而影响其生物利用性，若加入某种助剂以提高分散性，也许是提高微量元素生物利用的途径之一。重金属砷和镉的可溶态/总溶出（%）分别为42.9和27.0，以悬浮态居多，这可能对砂仁服用的安全性有利。
从kow参数看,在胃、肠液酸度下均大于1的元素有fe、mo和cd，而cu、zn、mn和co仅在肠液酸度下大于1，se仅在胃液酸度下大于1，cr在两种酸度下均小于1，ni仅检出胃液酸度下小于1。表明砂仁水煎液中，fe、mo和cd在胃、肠液酸度下均具有较高的醇溶态含量，其亲脂性、生物活性较强；同理，cr和ni的亲脂性、生物活性较弱。cu、zn、mn和co则在肠液酸度下表现出强的亲脂性、生物活性，尤其是cu、zn（kow﹥4），但随酸度提高，其在胃液酸度下醇溶态含量显著降低，如cu和zn的kow分别降为0.59和0.98，这可能显示cu、zn、mn和co等在砂仁水煎液中的存在形态稳定性不高，随酸度提高，元素结合或络合的其它成分发生变化，导致其结合的形态由醇溶态为主转化为水溶态为主，这也说明砂仁水煎液中这些元素的作用靶位可能位于肠部。se是人体必需微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的必需组分，具有增强机体免疫力、抗氧化性、抗毒性等重要生理功效，用于保健食品的开发前景倍受关注［3］，砂仁水煎液中se在胃液酸度下具有较高的kow值（3.1），说明此时的se处于有利于发挥其生理功效的形态。由于人体内不同靶位的ph有所不同，因此探讨中药水煎液中元素形态随ph的变化，可能对认清药物中元素在不同靶位的生物利用性有帮助，这在临床上有一定的意义。值得注意的是cd的kow参数大，且随ph的变化不大，因此应控制其亲脂性对药物安全性的影响。砂仁中由于cd的绝对含量低（没有超过wm2-2001规定的限量指标），水煎液中主要以悬浮态居多，因此综合考虑cd的存在应不会影响砂仁水煎液服用的安全性。
精密度与准确度实验结果表明，测定值与参考值有良好的一致性。分析方法线性好、精密度与准确度高。
【参考文献】
［1］胡玉兰，张忠义，林敬明. 中药砂仁的化学成分和药理活性研究进展［j］.中药材，2005，28（1）：72.
［2］胡广林，李 平,罗盛旭.中药微量元素溶出的研究概况［j］.微量元素与健康研究，2007,24(2):51.
［3］杨克敌.微量元素与健康［m］.北京：科学出版社，2003:153.
2.4 正辛醇-水分配体系模拟实验 取水煎液2组，用氨水和硝酸调节ph值，一组调为胃液酸度（ ph=1.3 )，另一组调为小肠液酸度（ph=7.60），于37℃放置过夜,移入分液漏斗中,每份均加入正辛醇5.0 ml,振荡萃取2 h,重复3次,合并3次萃取的水相和醇相。水相按“2.2”方法消化，定容至50.00 ml，用icp-ms法测定，扣除空白即得到水相中元素浓度cw，差减法算出醇相中元素浓度 c0，据此计算元素在醇相与水相中的分布参数kow= c0/cw。
3 结果
3.1 砂仁中微量元素的分布及溶出特性砂仁及其水煎液中元素的含量、水煎溶出率见表2。表2 砂仁中微量元素的含量和水煎溶出率（略）
3.2 水煎液中微量元素可溶态与悬浮态的分布水煎液中11种元素的可溶态、悬浮态及相关数据见表3。表3 砂仁水煎液中可溶态和悬浮态的分布（略）
3.3 水煎液中微量元素醇溶态与水溶态的分布正辛醇的结构与人体内的碳水化合物和脂肪类似，药理上常以正辛醇-水萃取体系测定药物的kow参数以评价药物的亲脂性及生物活性。实验测得胃、肠液酸度下砂仁水煎液在正辛醇-水萃取体系中醇溶态、水溶态元素含量及kow参数。结果见表4。表4 砂仁水煎液在正辛醇-水萃取体系中醇溶态、水溶态元素含量和kow（略）
3.4 分析方法的精密度与准确度采用icp-ms法，标准曲线的线性相关系数为0.999 8～1.000 0。该法测定砂仁中微量元素含量的rsd为0.1%～5.0%。结果见表5。测定标准物质灌木枝叶（gbw07603）中元素含量，除镉外（镉标准值非确定值），回收率在84.9%～123.3%之间。结果见表6。表5 砂仁中元素含量测定的相对标准偏差rsd（略）表6 标准物质灌木枝叶中元素含量和回收率（略）
4 讨论
砂仁富含mn、fe，也含较多的zn、cu，且mn（387.87 μg·g-1）＞fe（193.57 μg·g-1）＞zn（51.360 μg·g-1）＞cu（8.840 μg·g-1），它们都是重要的生命元素。同时砂仁还含有cr、ni、co、mo、se、sn等有益元素，含量范围为2.210～0.119 μg·g-1。有害元素pb、as、cd的含量分别为2.210 μg·g-1、0.786 μg·g-1、0.018 μg·g-1，其含量均没有超过我国商务部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》（wm2-2001）规定的限量指标（pb≤5.0 μg·g-1、as≤2.0 μg·g-1、cd≤0.3 μg·g-1）。因此，海南产砂仁pb、as、cd没有超标，且含有多种重要生命元素和有益元素。
从溶出率来看，砂仁中co的最高（93.3%），cu的最低（18.9%）,富含的mn、fe溶出率中等，有害元素溶出率靠后，溶出率由高到低的顺序为co＞zn＞se＞cr＞mn＞cd＞ni＞fe＞mo＞as＞cu。可见，砂仁中元素的溶出率并非按照元素在药材中总量的高低排序，其溶出特性主要与元素在药材中存在的化学与物理形态相关。砂仁中co溶出率高，是否预示co具有较强的生物利用性，尚有待深入研究。但动物缺乏co，会表现出食欲减退、体质衰弱、易疲劳，晚期发生不孕、腹泻和流产等［3］，这跟砂仁具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎的功效具有某种程度的一致性。由于中药服用方式是水煎液，微量元素溶出率理应是其生物利用性的重要指标。况且微量元素的溶出并非孤立，往往伴随有效成分（如活性金属有机物或配合物）的溶出，因此元素溶出率高低一定程度上也反映有效成分溶出的高低，若与中药临床疗效相结合以指导用药，可以赋予中药水煎剂一定的科学数据。
砂仁元素溶出以悬浮态居多，仅cr的可溶态/总溶出大于50%，这表明砂仁的元素可能主要以有机大分子结合态（如ni、se）、胶体态（如fe）或吸附性强的无机酸根离子态（如钼酸根）等被煎出，并在水煎液中聚集成较大颗粒，成为悬浮态。可溶态与悬浮态相比，前者可能以自由离子的形式或与某种低分子量配体结合的形式存在，颗粒小而易通过滤膜，较容易被人体吸收。砂仁水煎液中的cr以可溶态居多，zn、mn和co的可溶态也相对较多，它们的生物利用性可能是砂仁药理作用的重要组成部分。煎出元素形态的聚集性可能是形成悬浮态的重要因素，从而影响其生物利用性，若加入某种助剂以提高分散性，也许是提高微量元素生物利用的途径之一。重金属砷和镉的可溶态/总溶出（%）分别为42.9和27.0，以悬浮态居多，这可能对砂仁服用的安全性有利。
从kow参数看,在胃、肠液酸度下均大于1的元素有fe、mo和cd，而cu、zn、mn和co仅在肠液酸度下大于1，se仅在胃液酸度下大于1，cr在两种酸度下均小于1，ni仅检出胃液酸度下小于1。表明砂仁水煎液中，fe、mo和cd在胃、肠液酸度下均具有较高的醇溶态含量，其亲脂性、生物活性较强；同理，cr和ni的亲脂性、生物活性较弱。cu、zn、mn和co则在肠液酸度下表现出强的亲脂性、生物活性，尤其是cu、zn（kow﹥4），但随酸度提高，其在胃液酸度下醇溶态含量显著降低，如cu和zn的kow分别降为0.59和0.98，这可能显示cu、zn、mn和co等在砂仁水煎液中的存在形态稳定性不高，随酸度提高，元素结合或络合的其它成分发生变化，导致其结合的形态由醇溶态为主转化为水溶态为主，这也说明砂仁水煎液中这些元素的作用靶位可能位于肠部。se是人体必需微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的必需组分，具有增强机体免疫力、抗氧化性、抗毒性等重要生理功效，用于保健食品的开发前景倍受关注［3］，砂仁水煎液中se在胃液酸度下具有较高的kow值（3.1），说明此时的se处于有利于发挥其生理功效的形态。由于人体内不同靶位的ph有所不同，因此探讨中药水煎液中元素形态随ph的变化，可能对认清药物中元素在不同靶位的生物利用性有帮助，这在临床上有一定的意义。值得注意的是cd的kow参数大，且随ph的变化不大，因此应控制其亲脂性对药物安全性的影响。砂仁中由于cd的绝对含量低（没有超过wm2-2001规定的限量指标），水煎液中主要以悬浮态居多，因此综合考虑cd的存在应不会影响砂仁水煎液服用的安全性。
精密度与准确度实验结果表明，测定值与参考值有良好的一致性。分析方法线性好、精密度与准确度高。
【参考文献】
［1］胡玉兰，张忠义，林敬明. 中药砂仁的化学成分和药理活性研究进展［j］.中药材，2005，28（1）：72.
［2］胡广林，李 平,罗盛旭.中药微量元素溶出的研究概况［j］.微量元素与健康研究，2007,24(2):51.
［3］杨克敌.微量元素与健康［m］.北京：科学出版社，2003:153.
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