作者：钟振国， 梁红， 钟益宁， 张雯艳，
潘志海， 卢红梅， 韦小清， 黄金兰， 李鹏
【摘要】 目的探讨从余甘子叶提取分离得到的活性成分没食子酸的抗肿瘤作用。方法采用mtt法和细胞集落形成法观察没食子酸对人肝癌细胞株bele7404、人胃癌细胞株sgc7901、小鼠肝癌细胞株h22和小鼠肉瘤细胞株s180 4种肿瘤细胞的体外抑制作用。结果mtt法和细胞集落形成法测定的结果均显示，当没食子酸浓度在2.5 μg/ml 以上时，4种肿瘤细胞株的生长均受到明显抑制。结论余甘子叶提取成分没食子酸在体外对不同组织来源的肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用。
【关键词】 余甘子叶提取物 没食子酸 mtt法 细胞集落形成法 体外抗肿瘤作用
abstract：objectiveto isolate the anti-tumor activity components for gallic acid from the ethanol extract of the ethyl acetate fractions of the leaves of phyllanthus emblica l. methodsthe growth inhibition was analyzed by mtt and cell colony measurement technique in the hepatocellular carcinoma bele7404, stomach carcinoma sgc7901, hepatoma h22 and fibrosarcoma s180 cells line in smtt assay and cell colony measurement technique were indicated, the growth of four tumor cells were obviously inhibited when gallic acid concentration was at 2.5 μ g / ml and sionthe results suggest that gallic acid is cytotoxic to the variety of the cancer cells.
key words：extract from leaves of phyllanthus emblica l.； gallic acid; mtt; cell colony measurement technique; anti-cancer effect in vitro
余甘子叶phyllanthus emblica l.系大戟科(euphorbiaceae)叶下珠属phyllanthus落叶小乔木或灌木的叶。WWW.lunwen.net.cn余甘子树在我国主要分布在福建、广东、云南、贵州、四川、海南、广西等省区，资源丰富。《本草纲目》中记载:余甘子性凉, 味甘酸涩, 具有清热凉血、消食健胃、生津止咳之功效, 民间常用来 治疗 消化不良、腹泻、咳嗽、乙型肝炎、腹水、便秘、肿瘤、发热、皮肤病、高血压、胆囊炎及癌症等疾病［1］。余甘子叶在民间应用也较广泛，但有关余甘子叶的药理研究报道非常少。没食子酸是从余甘子叶提取分离出的两个化合物之一。为了了解没食子酸是否具有抗肿瘤作用，本实验将没食子酸在体外进行了抗癌活性研究。现报道如下。
1 材料与仪器
1.1 药物野生余甘子叶采自广西中部地区，经广西中医学院刘寿养教授鉴定。从余甘子叶提取分离得到化合物没食子酸。
1.2 肿瘤细胞株人胃癌细胞株sgc7901、人肝癌细胞株bele7404均购自上海细胞生物研究所细胞库；小鼠肝癌细胞株h22和小鼠肉瘤细胞株s180均购自广西中医药研究所。
1.3 试剂mtt（四甲基噻唑蓝）为德国sigma公司产品，批号：020609；fbs（胎牛血清）为美国hyclone公司产品，批号：0407；rpmi1640培养基为美国gibco公司产品，批号：1120708；trypisn (胰蛋白酶)购自天津市景洋生物制品有限责任公司，批号：200503；dmso（二甲基亚砜）购自天津汇英化学试剂有限公司，批号：20030526；wright,s stain（瑞氏染色素）购自上海三爱思试剂有限公司，批号：20011026；giemsa,s stain（吉氏染色素）购自上海试剂三厂，批号：20000324；卡那霉素，德国sigma公司分装；l-谷氨酰胺，amresco分装。
1.4 仪器co2培养箱（thermo forma），美国产，型号：381；倒置显微镜（olympus），日本产，型号：ck40；酶标仪（biocell），澳地利产，型号：sunrise；96孔板，丹麦产，型号：3072；低速台式离心机，上海安亭仪器厂，型号：tdl-5；层析柱: 各种不同规格口径的普通玻璃柱。
2 方法
2.1 rpm1640完全培养液的配置rpmi1640完全培养液含3%谷氨酰胺、卡那霉素750 μg/ml、10%或15%fbs。
2.2 mtt法测定［2］在96孔培养板中每孔加入200 μl（含有5 000个/ml肿瘤细胞）10%fbs的rpmi1640培养液，置37℃，10% co2培养箱中培养24 h后（h22、s180离心处理），弃去旧培养液。实验组分别加入新的培养液190 μl/孔，然后加入不同浓度没食子酸10 μl/孔，使终浓度分别为1.25，2.5，5，10，20，40，80 μg/ml,对照孔则加入200 μl/孔新的培养液。每组4平行孔, 置37℃, 10%co2培养液培养4 d后，弃去上清液，加入200 μl/孔新鲜配置的含0.2 mg/ml mtt的无血清培养液，37℃继续培养4 h。4 h后弃上清液，加入200 μl/孔dmso，振荡混匀后，用酶标仪（波长为570 nm，参比波长为450 nm）测定od值，按下式 计算 药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1-实验组平均od值/对照组平均od值）×100%［3］。
2.3 集落形成法［4］取对数生长期的sgc7901和bele7404肿瘤细胞株，用胰蛋白酶消化成分散细胞悬液，用10%fbsrpmi1640培养液配成含500个/ml细胞悬液，取35 mm培养皿，4个为一组，阴性对照组每皿加2 ml细胞悬液。实验组加入没食子酸100 μl，加入稀释后的细胞悬液2 ml，使没食子酸终浓度为20 μg/ml，摇匀后置37℃10%co2培养箱培养7 d，弃去培养液，先用瑞氏染液染色5 min，然后用giemsa' s溶液与sorensen磷酸缓冲液以1∶9配成冲洗液，染色10 min。流水冲洗、晾干，在20×的显微镜下计数含50个细胞以上的集落，重复4次。其中h22，s180用半固体软琼脂集落培养法，取对数生长期的h22和s180肿瘤细胞株,用15%fbsrpmi1640培养液配成含1 000个/ml细胞悬液，置37℃预温。取35 mm培养皿，4个为一组，每个实验组加入终浓度为20 μg/ml的没食子酸100 μl，对照组加入等体积的培养液，取在沸水中融化的5%琼脂液1份，加入到9份37℃含15%fbsrpmi1640培养液中，摇匀后迅速加入到培养皿中，每个皿1ml，混匀后，置室温使琼脂凝固。取预温的细胞悬液按每9.4ml加5%的琼脂液0.6ml的比例混匀，加到已铺底层琼脂的培养皿中，每皿1ml, 置室温使琼脂凝固。盖上培养皿盖，置37℃10%co2培养箱培养7 d，在16×的显微镜下计数直径大于75μm（50个细胞以上）的集落。按下式计算集落抑制率：
集落抑制率（%）=（1-克隆数/对照组克隆数）×100%［5］。
2.4 统计学处理以spss10.0统计软件分析，两组间的均数比较采用t检验。
3 结果
3.1 mtt法测定没食子酸对4种肿瘤细胞株生长的抑制结果见表1～4。表1 没食子酸对bele7404肿瘤细胞的抑制作用（略）与对照组比较，*p<0.01；n=4表2 没食子酸对sgc7901肿瘤细胞的抑制作用（略）与对照组比较，*p<0.01；n=4表3 没食子酸对s180肿瘤细胞的抑制作用（略）与对照组比较，*p<0.01；n=4表4 没食子酸对h22肿瘤细胞的抑制作用（略）与对照组比较，*p<0.01;n=4
结果显示，没食子酸对sgc7901、bele7404、h22、s180这4种肿瘤细胞株有一定的抑制作用，并与浓度呈正相关作用。
3.2 集落形成法观察没食子酸对4种肿瘤细胞株抑制作用结果见表5～8。表5 没食子酸在浓度为（略）与阴性对照组比较，*p<0.01；n=4表6 没食子酸在浓度为（略）与阴性对照组比较，*p<0.01；n=4表7 没食子酸和没食子酸乙酯在浓度为（略）与阴性对照组比较，*p<0.01；n=4表8 没食子酸和没食子酸乙酯在浓度为（略）与阴性对照组比较，*p<0.01；n=4
集落形成法的结果显示, 没食子酸对sgc7901、bele7404、h22、s180这4种肿瘤细胞株的集落形成也有抑制作用。
4 讨论
本实验通过采用两种不同的实验方法，研究余甘子叶提取物没食子酸在体外抗肿瘤作用。mtt法和集落形成法的结果相吻合，显示提取物对4类肿瘤细胞株生长均有抑制作用，其抑制率随着药物浓度增加而相应增高。提示余甘子叶提取物没食子酸在体外对肿瘤细胞生长具有抑制作用。
mtt法、集落形成法是观察体外抗肿瘤活性的常用方法，尤其mtt法快速简便，常作为抗肿瘤药的体外初筛试验，本研究采用两种实验方法的联合应用增加了实验结果的可靠性。
对恶性肿瘤目前尚无十分理想的 治疗 药物。近年来，从天然植物中寻找新的抗肿瘤药物已成为新药研究的主要 发展 方向之一，中医药在肿瘤治疗中的地位和综合优势愈显重要［6］。本研究从余甘子叶提取物中分离的没食子酸在体外实验均具有抗肿瘤作用，但其体内是否具有抑瘤作用尚需进一步深入研究。
【 参考 文献 】
［1］国家药典委员会.
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