作者：黄鸣清，陈瑞云，谢友良，蒋东旭，张怡评，江滨，赖小平
【摘要】 目的探讨盐酸水苏碱在中药生产过程中的含量变化及影响因素。方法建立盐酸水苏碱hplc含量测定方法，考察提取、浓缩、干燥工艺中各影响因素对盐酸水苏碱保留率的影响，分析益母草药材储藏过程中的各主要影响因素。结果水提取工艺中提取时间、提取温度、提取次数、水用量对盐酸水苏碱的影响较小；浓缩过程中盐酸水苏碱有一定损失，但浓缩温度、浓缩时间、真空度并非主要影响因素；干燥过程中的温度、真空度、时间等参数对盐酸水苏碱的影响较小。在益母草储藏过程中，见光降解是盐酸水苏碱含量下降的主要原因。结论光对盐酸水苏碱的稳定性有重大影响。
【关键词】 盐酸水苏碱 益母草 高效液相色谱 见光降解
abstract：objectiveto explore the content change of stachydrine hydrochloride in chinese medicine production san hplc method was established stachydrine hydrochloride to determine the content of retention rate of stachydrine hydrochloride was applied as the parameters to investigate the processes of extraction, concentration and drying and the main factors in the storage of herba leonuri was investigated by factorial sthe influence of time, temperature, frequency, and water volume in extraction process to stachydrine hydrochloride was weak. there is a little loss of stachydrine hydrochloride in concentration process; the influence of temperature, time, and vacuum value to stachydrine hydrochloride was weak. decompose by light was the most important factor to content decline of stachydrine hydrochloride in the storage of herba leonuri. conclusionlight showed a marked influence on the stability of stachydrine hydrochloride.
key words：stachydrine hydrochloride； herba leonuri； hplc； decompose by light
益母草为唇形科植物益母草leonurus japonicus houtt.的新鲜或干燥地上部分，主治月经不调、胎漏难产、行经腹痛及产后瘀阻等症，有“血家圣药”“经产良药”之称。近年来其逐步被应用于心脑血管疾病的防治，临床效果较好，疗效甚至超过复方丹参注射液［1］。现代药理研究表明［2］，益母草中的益母草碱、盐酸水苏碱等多种生物碱具有较强的兴奋子宫、抗血小板聚集、降低血液黏度、抑制血栓形成等作用。
据统计，药典及部颁标准中含益母草的多数中成药，其盐酸水苏碱的理论保留率［理论保留率（％）＝成品中待测成分的标示总量/处方中待测成分的药典规定最低总量×100%］均低于40％。在产后逐瘀胶囊及妇血安片的成品检验中同样发现，两者的盐酸水苏碱理论保留率均低于20％，部分批次甚至不合格。同时，在对益母草药材进行筛选的过程中发现，各产地的药材盐酸水苏碱含量差异较大，且同一产地新上市药材的含量明显高于去年上市的老药材。为了考察其原因，本研究探讨了中药生产中提取、浓缩、干燥工艺过程对盐酸水苏碱含量的影响，并对益母草药材的稳定性影响因素进行了初步研究。
1 仪器与试药
hp1100高效液相色谱仪(g1322a degasser，g1311a quatpump，g1313a als，g1316a colcom，g1315a dad) hp chemstation色谱工作站；kq3200de型医用数控超声仪（昆山市超声仪有限公司）；gl45型密闭耐压瓶（schott）；n-11型旋转蒸发仪（日本eyela）；cs101-1e电热鼓风干燥箱（重庆万达仪器有限公司）；dzf-6050真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；b-290 buchi minispray-dryer（瑞士buchi公司）；hwz-b型动态微波真空干燥机（广州兴兴微波能设备有限公司）。
益母草药材购于广州清平药材市场，经广州中医药大学赖小平教授鉴定；盐酸水苏碱对照品（供含量测定用，批号：110712-200407），购自中国药品生物制品检定所；磷酸二氢钾、三乙胺、磷酸是分析纯。
2 方法与结果
2.1 盐酸水苏碱含量测定
2.1.1 色谱条件
phenomenex luna scx色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为0.05 mol·l-1磷酸二氢钾（含0.03％三乙胺和0.1％磷酸，ph=3）；流速1 ml·min-1，柱温30 ℃，进样量10 μl。盐酸水苏碱在上述色谱条件下与其他成分实现了基线分离。见图1～2。
2.1.2 标准曲线的绘制
取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加0.1 mol·l-1盐酸溶制成每毫升含盐酸水苏碱1 mg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液2，4，6，8，10，12 μl进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量（y，μg）对峰面积（x, mau×sec）进行线性回归，回归方程为：y=290.44x +125，r=0.999 8。
2.1.3 供试品溶液的制备
取样品溶液，盐酸调节ph值至1～2，通过d101大孔树脂（内径1.5 cm,柱高10 cm），以0.1 mol·l-1盐酸溶液150 ml洗脱，合并洗脱液；将上述洗脱液通过001×7（732）强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（内径1.5 cm，柱高15 cm），水洗至流出液呈中性，弃去水洗脱液；再用2 mol·l-1氨溶液150 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用0.1 mol·l-1盐酸溶液溶解并转移至5 ml容量瓶中，加0.1 mol·l-1盐酸溶液至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。精密吸取10 μl，进样，按上述色谱条件进行hplc测定，即得。
2.2 水提取工艺对盐酸水苏碱的影响
结合益母草生产中多以水为提取溶媒的实际情况，为考察水提取过程中各工艺参数对盐酸水苏碱含量的影响，本研究选用l9（34）正交表进行实验，设定提取时间、提取温度、提取次数、水用量为考察因素（见表1），以盐酸水苏碱总量为考察指标。结果见表2。对表2结果进行统计学处理。结果见表3。
表1 因素水平，表2 正交实验方案及结果，表3 方差分析（略）。
极差及方差分析结果表明，各因素对提取效果的影响程度依次为b﹥c﹥a﹥d，但各因素均无显著性差异。结果显示，随着各工艺参数强度的增加，其盐酸水苏碱提取率也逐渐升高，最高达到93％。提示常规水提取工艺过程对盐酸水苏碱的影响较小。
2.3 浓缩工艺对盐酸水苏碱的影响
模拟生产状态下水提取液在浓缩过程中常采用的工艺参数，以考察浓缩过程对盐酸水苏碱的影响。将益母草切段（1 cm左右），称取500 g，加20倍量水80℃温浸2 h，滤过，滤液备用。将所得滤液加水补足至6 000 ml，等分成12份，每份500 ml，置于旋转蒸发仪中，通过控制加热温度（70～100 ℃）、真空度（-0.07 mpa～常压），分别使其浓缩至稠膏状态（10 g左右），记录相应浓缩时间，并按照前面建立的盐酸水苏碱含量测定方法测定含量，并计算盐酸水苏碱总量及实际保留率［实际保留率（％）＝样品中待测成分的实际总量/投料药材中待测成分的实际总量×100%］。结果见表4。表4 不同浓缩状态下盐酸水苏碱的含量测定（略）
结果显示，在常压浓缩及不同温度的减压浓缩状态下，益母草提取液中的盐酸水苏碱总量均有所降低，各状态间相差并不明显。提示浓缩过程对盐酸水苏碱有一定影响，但浓缩温度、真空度、时间等并非主要影响因素。
2.4 干燥工艺对盐酸水苏碱的影响
结合目前国内中药生产的实际情况，分别考察常压干燥、减压干燥、真空微波干燥、喷雾干燥等常用干燥方法对盐酸水苏碱的影响。将益母草切段（1 cm左右），称取2 000 g，加20倍量水80 ℃温浸2 h，滤过，滤液减压浓缩（温度90 ℃，真空度-0.07 mpa）至相对密度为1.15（80 ℃）的清膏，等分成4份，分别采用常压105 ℃干燥，真空干燥（温度80 ℃，真空度-0.08 mpa），真空微波干燥（温度75 ℃，真空度-0.08 mpa），喷雾干燥（入口风温度180 ℃，出口风温度100 ℃）。每步均取样测定盐酸水苏碱的含量，并计算盐酸水苏碱总量及实际保留率，结果见表5。表5 不同干燥工艺对盐酸水苏碱含量的影响（略）
结果显示，盐酸水苏碱保留率的高低顺序为真空微波干燥﹥喷雾干燥﹥真空干燥﹥常压干燥，干燥时间以喷雾干燥、真空微波干燥最少。提示干燥过程中的温度、真空度、时间等参数对盐酸水苏碱的影响较小。
2.5 益母草药材稳定性研究
结合上述提取浓缩干燥工艺的研究结果，将温度因素排除后，初步分析益母草药材在储存过程中出现含量下降的因素可能包括酶解、见光降解等，并按照析因设计法进行以下实验：①普通处理：取益母草药材1 000 g，分装于透明塑料封口袋中，封口，室温保存；②灭酶处理：取益母草药材1 000 g，置于高压灭菌锅中，121 ℃高压灭菌20 min，取出，晒干，分装于透明塑料封口袋中，封口，室温保存；③避光处理：取益母草药材1 000 g，分装于铝箔袋中，封口，室温保存；④灭酶、避光处理：取益母草药材1 000 g，置于高压灭菌锅中，121 ℃高压灭菌20 min，取出，晒干，分装于铝箔袋中，封口，室温保存。以上各批试验分别于0，1，2，3，5，8，12月进行取样，测定盐酸水苏碱的含量，并采用spss统计软件对各组保留率进行析因分析，结果见表6。表6 益母草药材稳定性研究（略）
表6及析因分析结果表明，见光降解为盐酸水苏碱含量下降的主要原因（p﹤0.01），酶解并非其主要原因（p﹥0.05），且不存在交互作用（p﹥0.05）。在缺乏避光处理的情况下，益母草药材中的盐酸水苏碱保留率急剧下降，储存1年后仅保留40％左右。
3 讨论
在hplc样品制备过程中，通过结合使用大孔树脂和离子树脂，减少了杂质成分对盐酸水苏碱在紫外末端吸收的干扰影响，使本方法的简便性、重复性较《中国药典》2005版所采用的tlcs显著提高。产后逐瘀胶囊及妇血安片的hplc含量测定结果表明，本方法同样适用于含益母草中成药的含量测定。
中药生产包含炮制加工、储藏、煎煮、浓缩、干燥等过程，各过程中已知有效成分所受到的影响因素及作用大小又不尽相同。在本研究中，针对含益母草成药中盐酸水苏碱含量低下的问题，我们对益母草的常规水提取、浓缩、干燥工艺进行细致研究。结果表明，盐酸水苏碱在提取、浓缩、干燥过程中没有明显损失，即高温、高压、湿热等并非其主要影响因素。排除生产中可能存在的原因后，本研究对益母草药材的自身稳定性按照析因设计进行研究。结果表明，盐酸水苏碱易见光降解，储存一年后的益母草药材中盐酸水苏碱保留率仅为40％左右。盐酸水苏碱见光降解的具体机制及益母草提取物是否同样会发生降解反应等尚未明确，仍有待进一步研究。本研究提示，在进行益母草相关品种研究时，应足够重视药材或成品的避光保存。
【参考文献】
［1］陶丽华，高峰，李虎将．益母草用于治疗缺血性疾病的临床应用［j］．通化师范学院学报，2003，24(6)：29．
［2］阮金兰，杜俊蓉，曾庆忠，等． 益母草的化学、药理和临床研究进展［j］．中草药，2003，34（11）：15.
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