作者：张体祥，刘捷，张萍，马丽，卢奎
【摘要】 目的研究板蓝根水溶性多糖的提取纯化工艺条件。方法通过正交实验，考察液料比、提取时间、提取温度、醇沉时间、醇液比对多糖得率的影响。结果液料比是影响提取工艺的主要因素，最佳工艺条件为：液料比30∶1，提取温度90℃，提取时间6 h。三氯乙酸法脱蛋白，葡聚糖凝胶柱层析纯化分离。结论板蓝根多糖得率25.63%，多糖含量76.42%。纯化后的板蓝根多糖为分子大小均一的单一组分多糖，不含核酸和蛋白质。
【关键词】 板蓝根多糖 正交试验 提取 纯化 分离
板蓝根为 中国 传统中药，有清热解毒、凉血利咽的功能。用于瘟毒发斑、舌绛紫暗、痄腮、喉痹、烂喉丹痧、大头瘟疫、丹毒、痈肿等症［1］。板蓝根多糖是板蓝根的主要化学成分之一。研究发现, 板蓝根多糖具有免疫调节作用, 对特异性免疫和非特异性免疫均有一定的促进作用［2，3］, 此外还有降血脂作用。 随着人们对多糖生物活性和特殊药用功能认识的进一步加深，意识到板蓝根多糖可能是板蓝根生物活性和特殊药用功能的主要作用因子之一。
目前, 板蓝根多糖的提取大多采用水煮醇沉法［4，5］, 提取的粗多糖溶液为胶体溶液, 性质差别很大, 提取得率和多糖含量并不理想，这为多糖的的进一步开发造成了困难。为了提高多糖的活性, 本实验以北板蓝根为原料, 采用正交实验对板蓝根的提取工艺进行优化, 对提取的粗多糖脱蛋白, 通过sehadex g-100凝胶色谱柱进一步分离纯化, 以期为板蓝根多糖的开发利用提供理论基础。
1 材料
板蓝根，购自郑州仟僖堂药店。
2 方法
2.1 板蓝根多糖的提取纯化工艺路线［6，7］其流程如下所示：
提取：板蓝根→粉碎→称量→乙醚脱脂→热水浸提→离心取上清液→残渣重复浸提两次→合并上清液→减压浓缩→透析→测含糖量→乙醇沉淀→有机溶剂洗涤→真空干燥→板蓝根粗多糖
纯化：粗多糖溶液 → sehadex g-100柱层析→洗脱液浓缩→乙醇沉淀→冷冻干燥→精制板蓝根多糖
2.2 正交实验优化板蓝根多糖的提取工艺选择液料比、提取温度和提取时间3个因素，以多糖得率为考察指标进行3因素3水平的正交实验，对板蓝根多糖的提取工艺条件进行优化。
2.3 多糖含量的测定［8］苯酚-硫酸法，以葡萄糖为基准物作标准曲线。根据标准曲线 计算 多糖含量。
板蓝根多糖得率的计算公式:
粗多糖得率（%）=多糖质量板蓝根粉末的质量×100%
2.4 脱蛋白方法称取一定量板蓝根粗多糖，加入蒸馏水溶胀2 h，在100℃下煮沸1.5 h，离心，浓缩。本实验采用了4种去蛋白方法：
sevage法：在粗多糖浓缩液中加入等体积的一定浓度的氯仿-正丁醇溶液，混合振摇，离心除去沉淀，经透析、醇沉、洗涤、干燥，即得脱蛋白多糖。
三氯乙酸法：在粗多糖浓缩液中滴加一定量的三氯乙酸，剧烈搅拌20～30 min，离心除去沉淀，经透析、醇沉、洗涤、干燥，即得脱蛋白多糖。
hcl法：用hcl调节粗多糖浓缩液至ph=3，10～20℃静置过夜，离心除去沉淀液，再透析醇沉、洗涤、干燥，即得脱蛋白多糖。
正丁醇-三氯乙酸法：在粗多糖浓缩液中加入等体积的三氯乙酸-正丁醇试剂，振摇10 min，于分液漏斗中静置分层，收集下层的水溶液，经透析醇沉、洗涤、干燥，即得脱蛋白多糖。
2.5 板蓝根多糖的纯化将一定量的脱蛋白多糖，用蒸馏水溶解后上样，0.15 mol·l-1 nacl进行洗脱，流速控制在0.3 ml·min-1，洗脱液由分布收集器进行收集，苯酚-硫酸法跟踪检测，分别合并出峰的流出液，减压浓缩至一定体积，醇沉、过滤、干燥，即得精制多糖。
2.6 纯度鉴定将sephadex g-100装柱，用nacl平衡1 d。上样，nacl洗脱，按3 ml体积部分收集，用苯酚-硫酸法跟踪检测。配制一定浓度的板蓝根多糖溶液，以二次重蒸水为空白， tu-1800pc紫外分光光度计于190～800 nm的范围进行扫描。
3 结果
3.1 液料比对多糖得率的影响固定提取温度为90℃，提取时间为7 h，醇沉比4∶1，醇沉时间24 h, 称取一定量板蓝根分别在5∶1，10∶1，20∶1，30∶1，40∶1条件下提取。结果见图1。
由图1可以看出，随着液料比的增大，多糖得率呈上升趋势，当液料比达到25∶1，多糖得率变化不大。如果水用量过多, 不利于以后的浓缩分离。因此, 选择液料比在25∶1左右。
3.2 提取温度对多糖得率的影响按照液料比25∶1，提取时间7h，醇沉比4∶1，醇沉时间24 h, 称取一定量板蓝根分别在60，70，80℃，90，95，100℃温度下提取。结果见图2。
由图2可以看出，提取温度从60℃升高到90℃时，多糖的得率迅速增加，超过90℃则多糖的得率变化平缓，而温度达到95℃之后多糖的得率反而有所下降。若温度过低，溶剂的渗透能力和溶解能力差，多糖不能有效溶出；温度过高虽对细胞的破坏作用增大，有利于多糖的浸出，但是会导致多糖裂解，使得多糖得率降低。所以, 提取温度选择80～95℃时效果较好。
3.3 提取时间对多糖得率的影响固定液料比25∶1，提取温度为90℃，醇沉比为4∶1，醇沉时间为24 h, 取一定量板蓝根分别在5，6，7，8，9 h下提取。结果见图3。随着提取时间的延长，多糖的得率逐渐增加，到7 h后多糖得率增加缓慢。故提取时间选择6～8 h时效果较好。
3.4 醇液比对多糖得率的影响由图4可以看出，随着乙醇与多糖浓缩液比例的增加，多糖得率呈增加趋势，当醇液比达到4∶1后，多糖得率增加不明显。因此，醇液比选择4∶1～5∶1时效果较好。
3.5 醇沉时间对多糖得率的影响由图5可以看出，随着醇沉时间的延长，多糖得率逐渐增加， 24 h后多糖得率降低，但是醇沉时间对多糖得率影响不大。因此, 醇沉时间选择16～24 h之间。
3.6 正交实验在单因素实验的基础上，确定液料比、提取时间和提取温度作为实验因素，设计3因素3水平的l9(34)正交表，以多糖得率为指标对各因素进行评价和选择，见表1，正交实验结果见表2。表1 因素水平（略）
从表2可以看出，影响板蓝根多糖得率因素的顺序为：液料比>提取温度>提取时间，最优工艺组合为a3b2c1，故最佳提取条件为液料水比为30∶1，提取温度为90℃，提取时间为6 h。表2 正交实验（略）
3.7 验证实验按照板蓝根多糖提取的最佳条件: 液料比30∶1，提取温度90℃，提取时间6h，醇沉比例4∶1，醇沉时间24 h进行验证实验，板蓝根多糖的得率为25.63%，多糖含量为76.42%。
3.8 板蓝根多糖的纯化
3.8.1 脱蛋白方法的选择为选取最优的脱蛋白方法，以多糖含量和a280吸光值作为指标, 分别采用sevage法、三氯乙酸法、hcl法、正丁醇-三氯乙酸法4种方法进行比较。结果见表3。正丁醇-三氯乙酸法的a280吸光值最小，多糖含量最高，除蛋白效果较好，但是多糖得率较低，；三氯乙酸法的多糖得率较高，多糖含量达到91.46%，a280吸光值为0.106，除蛋白效果也较好。综合各方面因素, 本实验选用三氯乙酸法去除板蓝根多糖的蛋白质。表3 4种脱蛋白方法的比较（略）
3.8.2 葡聚糖凝胶（sephadex g-100）柱层析纯化分离 板蓝根多糖sephadex g-100柱层析纯化分离的洗脱曲线如图6。出现4个洗脱峰, 收集其中含量最高所对应的5～7号管, 透析, 浓缩, 加入3倍体积95%乙醇, 离心分离, 冷冻干燥, 得到板蓝根多糖。
3.9 纯度鉴定对sephadex g-100层析柱上纯化分离得到的5～7管的板蓝根多糖组分在190～ 800 nm范围进行扫描，结果见7～8。在260 nm和280 nm处无核酸和蛋白质的特征吸收峰,说明产品中不含核酸和蛋白质。经sephadex g-100柱层析洗脱，所得的峰形状为对称的单一峰，表明纯化后的板蓝根多糖为分子大小均一的单一组分多糖。
4 结 论
利用水煮醇沉法从板蓝根中提取水溶性多糖, 通过单因素实验和正交实验对板蓝根多糖的提取工艺进行优化, 确定的最佳提取条件为: 液料比30∶1，提取温度90℃，提取时间6 h，板蓝根粗多糖的得率为25.63%，多糖含量达到76.42%。
对脱蛋白方法进行了优化, 采用三氯乙酸法去蛋白的多糖得率43.87%, 多糖含量91.46%, 脱蛋白效果好。
利用葡聚糖凝胶sephadex g-100柱层析对板蓝根粗多糖进行纯化分离, 收集主峰。纯化后的板蓝根多糖为单一组分多糖, 不含核酸和蛋白质。这为下一步对板蓝根多糖的分离纯化和结构的分析奠定了基础。
【 参考 文献 】
［1］国家药典委员会.
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