作者：刘东洋， 史国兵， 赵庆春
【摘要】 目的建立同时测定蜂房药材中没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸含量的方法。方法采用hplc法，梯度洗脱。色谱柱为kromasil ods-c18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇水(三氟乙酸调ph至5)，流速1.0 ml/min，柱温25 ℃，检测波长254 nm。结果没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸质量浓度与峰面积均呈良好的线性关系,平均回收率分别为98.9%(rsd为1.01)，98.4%(rsd为1.18%),97.3%(rsd为1.18%）。结论所建方法准确、重复性好、专属性强，可为蜂房质量标准的控制提供依据。
【关键词】 hplc； 蜂房； 没食子酸； 对羟基苯甲酸； 原儿茶酸
蜂房（nidus vespae）为胡蜂科昆虫果马蜂 polistes olivaceous (de geer)、日本长脚胡蜂 polistes japonicus saussure 或异腹胡蜂 parapolybia varia fabricius 的巢。2005年版《中国药典》中记载蜂房具有“祛风，攻毒，杀虫，止痛”的作用［1］。wWw.lunwen.net.cn《中药大辞典》中记载蜂房药液具有“去腐、生肌、消炎、止痛等作用，并能促进创口早期愈合”［2］。近年来国内多篇文献报道蜂房临床疗效显著，大多数集中于抗肿瘤与抗炎两个方面，已有文献明确指出抗肿瘤物质基础在于它所含有的极性低的脂肪酸类［3］，而关于抗炎作用的物质基础研究报道甚少。
本科室研究发现，蜂房的水煎液具有抗炎活性，而正丁醇提取物抗炎活性明显，主要有效成分为酚酸类和少量的含氮类化合物，但没有进行关于蜂房抗炎成分的质量控制方法的研究。为了进一步对蜂房药材进行科学评价，本研究对16批蜂房药材进行了hplc比较分析，首次建立了同时测定蜂房药材中主要成分没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸含量的方法［4］，为蜂房药材质量控制提供了借鉴。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：waters600e泵，waterspad996二极管阵列检测器；旋转蒸发仪（sb–1000,n–1000,日本东京理化株式会社）；紫外分光光度仪（uv–2501pc，日本shimadzu公司）；电子分析天平（uv120d，日本shimadzu公司）。高效液相色谱用试剂：甲醇(色谱纯)，水(三蒸水)，三氟乙酸(分析纯)；没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号：110836-200302、110648-200318、110754-200307)。实验室用药材，由沈阳药科大学中药教研室孙启时教授鉴定为蜂房（nidus vespae）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为kromasil ods-c18(250 mm×4．6 mm，5 μm)；流动相为甲醇(a)水(三氟乙酸调ph至5)(b)；梯度洗脱程序：0 min (0% a)，15 min (8% a)，18 min (12% a)，30 min (15% a)，45 min (18% a)；体积流量：1.0 ml／min；检测波长254 nm；柱温25℃。色谱图见图1。
2.2 供试品溶液的制备称取剪碎的蜂房药材(辽宁沈阳)2 g，用20倍水煎煮3次，水煎液用滤纸过滤，所得滤液浓缩至约10 ml；将浓缩液醇沉12 h，之后过滤得醇沉液；醇沉液减压浓缩至无醇味，用水25 ml分次定量转移至分液漏斗中，正丁醇等体积萃取3次，萃取液合并，旋转蒸发至干，用甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 对照品溶液的制备精密称没食子酸对照品8.0 mg、对羟基苯甲酸对照品7.6 mg和原儿茶酸对照品11.1 mg,分别置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶液并稀释到刻度，摇匀即得，作为对照品储备液。分别精密吸取上述贮备液1.0 ml，置同一10 ml量瓶中，用甲醇溶液并稀释到刻度，摇匀即得，作为对照品溶液。
2.4 线性关系的考察 精密吸取对照品溶液0.04，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，1.8 ml，分别置于2 ml量瓶中，用甲醇溶液并稀释到刻度，摇匀，分别进样5 μl。以各成分峰面积为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x）,绘制标准曲线，计算回归方程：y没食子酸=8.97×106x+7 317.1, r=0.999 6,线性范围1.6～72.0 μg/ml；y对羟基苯甲酸=1.95×107x-73 247,r=0.999 5,线性范围1.52～68.4 μg/ml；y原儿茶酸=5.01×107x-169 012，r=0.999 8，线性范围2.22～99.9 μg/ml。
2.5 精密度实验取同一供试品溶液，分别连续进样6次，测定没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸峰面积，结果rsd分别为0.41％，0.56%和0.72％，均小于2％，表明仪器精密度良好。
2.6 重复性实验取同一批蜂房样品6份（辽宁沈阳），按供试品溶液的制备方法制备成6份，分别进样5 μl，结果，没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸峰面积的rsd分别为0.83％，0.74%和0.95％，均小于2％，表明方法重复性良好。
2.7 稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，24 h进样5 μl。结果，没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸的峰面积的rsd分别为1.72％，1.61%和2.19％，均小于5％，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 回收率实验精密称取6份已知含量的辽宁沈阳蜂房（没食子酸含量0.256 mg·g-1，对羟基苯甲酸0.365 mg·g-1，原儿茶酸0.327 mg·g-1）1 g,分别加入没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸对照品溶液适量，按“2.2”项下操作，计算回收率。结果没食子酸平均回收率98.9%，rsd=1.01%；对羟基苯甲酸平均回收率98.4%，rsd=1.18%；原儿茶酸平均回收97.3%，rsd=1.18%。结果见表1。表1 回收率测定结果（略）
2.9 不同产地样品测定分别取不同产地的蜂房1 g，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样5 μl，测定峰面积，根据标准曲线计算样品中没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸的含量。结果见表2。表2 样品来源及含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 检测波长的选择采用waters二级管阵列检测器对检测波长进行了选择，首先从中选出243，254，261 nm 3个分离度较好的波长，然后进一步通过分析比较这3个波长下的图谱，发现检测波长为254 nm时，3种酚酸均有最大吸收，且色谱峰分离较好，基线较平稳。
3.2 流动相的选择化合物在色谱柱上的保留行为与其化学结构有关，没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸化学结构有着一定差别，对羟基苯甲酸、原儿茶酸保留时间远大于没食子酸，等度洗脱不适宜同时测定这3种成分，故采用梯度洗脱，可缩短分析时间，同时定量3个成分；分别用甲醇-水(加三氟乙酸）、乙腈-水、乙腈-磷酸盐缓冲体系为流动相，以不同梯度进行试验，结果表明用甲醇-水（三氟乙酸调ph至5）线性梯度洗脱效果最好。
3.3 提取条件的选择 蜂房提取选用传统的水煎醇沉工艺，但要考虑选加水量、煎煮时间、煎煮次数和醇沉浓度的因素，选用l9(34)正交方案，系统考察了4个因素对蜂房提取工艺的影响，选定蜂房最优提取工艺，即每次用20倍量的水煎煮3次，总提取时间为4 h，醇沉浓度为60%。
3.4 提取溶媒的选择通过对提取溶媒的考察，蜂房水煎液的正丁醇提取物抗炎活性明显；此外，通过对蜂房水煎液正丁醇提取物与水层图谱比较，没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸的峰面积显著提高，杂质明显减少。蜂房水煎液的正丁醇层提取物，不仅有利于3种酚酸类化合物的含量测定，更有利于不同产地蜂房抗炎活性的比较。
本实验建立了蜂房药材中没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸的含量测定方法，该方法方便、快捷、可靠；结果表明不同产地蜂房中3种酚酸的含量存在一定差异，以辽宁丹东、湖南和广东中山蜂房药材中3种酚酸的含量较高，考虑的可能因素有产地、加工、采用季节、储存时间和方式等。
【参考文献】
［1］国家药典委员会. 中国药典，ⅰ部［s］. 北京: 化学工业出版社， 2005:249.
［2］江苏新医学院. 中药大辞典［m］. 上海: 上海科学技术出版社，1975: 2736.
［3］赵维成，肖 伟，于德泉，等.蜂房抗肿瘤成分的提取及分析检测［j］.实用肿瘤学杂志，2000，14（1）：14.
［4］王 伟，赵庆春，安 晔，等. 中药蜂房化学成分的研究［j］.中国药物化学杂志，2008，18（1）：54.
中国论文网(www.lunwen.net.cn)免费学术期刊论文发表,目录,论文查重入口,本科毕业论文怎么写,职称论文范文,论文摘要,论文文献资料,毕业论文格式,论文检测降重服务。
