毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷的含量

中国论文网 发表于2022-11-06 23:28:09 归属于药学论文 本文已影响325 我要投稿 手机版

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作者:杨慧文,王晓可,毋福海

【摘要】 目的 建立栀子金花丸中黄芩苷的含量测定方法。方法 采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(60 cm× 75 μm,有效长度52 cm),以40 mmol·l-1硼砂溶液(ph9.0)为运行缓冲液;分离电压为12 kv;重力进样10 s(高度15 cm);检测波长为280 nm;以对硝基苯甲酸为内标。结果 黄芩苷质量浓度在7.5~52.5 μg·ml-1范围内具有良好的线性关系(r=0.999 6),黄芩苷平均回收率为96.7%,rsd值为1.62%(n=6)。结论 该方法专属性强,结果准确可靠、重现性好,可用于栀子金花丸的质量控制。

【关键词】 毛细管电泳法;栀子金花丸;黄芩苷

  abstract:objective to establish the method for the determination of baicalin in zhizijinhua pills by capillary electrophoresis. methods the separation was performed in an uncoated fused silica capillary of 60 cm×75 μm id (52 cm effective length).the running buffer wes 40 mmol·l-1 na2b4o7 buffer solution(ph9.0).the voltage applied was 12 kv. the sample was injected by gravity(10 s,15 cm). the detection wavelength was 280 nm,and the internal standard was pnitrobenzoic acid. results the linear range of baicalin was 7.5-52.5 μg·ml-1(r=0.999 6). the average recovery for baicalin was 96.7%(rsd=1.62%,n=6). conclusion the method proved to be exclusive,convenient,rapid and well repeatable,and can be used for quantitative determination of zhizijinhua pills.

  key words:capillary electrophoresis;zhizijinhua pills;baicalin

 栀子金花丸是由栀子、黄芩、黄连、黄柏等8味药材制成的中药成方制剂,具有清热泻火、凉血解毒之功效。临床用于肺胃热盛,口舌生疮,牙龈肿痛,目赤眩晕,咽喉肿痛,吐血衄血,大便秘结等的 治疗 。栀子金花丸的现行标准采用hplc法测定制剂中栀子苷的含量[1],亦有其他 文献 报道采用hplc法测定其中黄芩苷、栀子苷、绿原酸等成分的含量 [2~6],但采用毛细管电泳法对栀子金花丸进行质量控制的方法尚未见报道。本文采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷的含量,为更好地控制栀子金花丸质量提供了依据。

  1 仪器与试药

  1.1 仪器

  cl1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆 科学 仪器有限公司),knauer k2501紫外-可见检测器(德国),hw2000色谱工作站2.17版(南京千谱软件有限公司)。orion model 828型ph计(美国)。dl360超声波清洗器[宁波石浦海天 电子 仪器厂,频率(4.5±0.225)khz,功率240 w]。未涂层弹性融硅石英毛细管柱(河北锐年永沣色谱器件有限公司)。

  1.2 试药

  黄芩苷( 中国 药品生物制品检定所,批号110715-200815)。栀子金花丸(山东孔圣堂制药有限公司,批号090457、090546、090741,规格 9 g·袋-1)。甲醇为色谱纯;硼砂、对硝基苯甲酸、naoh均为分析纯;水为双蒸水。

  2 方法与结果

  2.1 溶液的制备

  2.1.1 内标溶液的制备 精密称取对硝基苯甲酸适量,加水制成100 μg·ml-1的内标贮备液。

  2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取在60 ℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品15 mg,置100 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液(黄芩苷质量浓度为150 μg·ml-1)。

  2.1.3 供试品溶液的制备 取栀子金花丸样品,研碎,取约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%(体积分数)甲醇50 ml,称定重量,超声处理40 min,放冷,再称定重量,用70%(体积分数)甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液10 ml至蒸发皿中,水浴挥干,再用70%(体积分数)甲醇溶解转移至10 ml量瓶中,加入内标溶液2.5 ml,用70%(体积分数)甲醇稀释至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。

  2.1.4 阴性对照液的制备 取处方组成中除黄芩外的其余药材,制成不含黄芩的阴性对照品,按“2.1.3”项下方法处理,即得。

  2.1.5 运行缓冲液的制备 精密称取硼砂适量,加水制成40 mmol·l-1硼砂溶液(ph=9.0),0.45 μm微孔滤膜滤过,作为运行缓冲液。

  2.2 电泳条件

  采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(60 cm×75 μm,有效长度52 cm);以40 mmol·l-1硼砂溶液(ph9.0)为运行缓冲液;分离电压为12 kv;重力进样10 s(高度15 cm);检测波长为280 nm;温度为室温,湿度小于70%。毛细管柱在使用前依次用0.1 mol·l-1 naoh溶液和水冲洗15~20 min,再用运行缓冲液冲洗约5 min。以对硝基苯甲酸为内标。在此条件下进行测定,对照品、供试品、阴性对照溶液色谱图见图1。

  2.3 方法学考察

  2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品贮备液适量,加甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0、52.5 μg·ml-1,内标物质量浓度为25.0 μg·ml-1的溶液。依次重力进样10 s,每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(y),黄芩苷质量浓度(ρ)为横坐标进行线性回归,得回归方程y=0.0350ρ-0.0383,r=0.999 6。表明黄芩苷在7.5~52.5 μg·ml-1范围内线性关系良好。

  2.3.2 精密度试验 取质量浓度为30.0 g·ml-1的黄芩苷对照品溶液,按“2.2”项下电泳条件,连续测定5次,记录峰面积并 计算 rsd值。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.99%,表明仪器精密度良好。

  2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号090741),在0、2、4、6、8、12 h分别重力进样10 s,记录峰面积并计算rsd。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.65%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

  2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号090741)的栀子金花丸样品6份,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定。结果栀子金花丸中黄芩苷的平均含量为1.63 mg·g-1,rsd=1.62%(n=6)。表明重复性良好。

  2.3.5 加样回收率试验 精密称取栀子金花丸样品(批号090741)共6份,加入黄芩苷对照品适量,按“2.1.3”项下方法处理并依法测定,计算回收率,结果见表1。栀子金花丸中黄芩苷的平均回收率为96.7%,rsd=2.15%。表1 加样回收率试验

  2.4 样品测定

  取栀子金花丸样品3批,按“2.1.3”项下方法处理后依法测定,记录峰面积,代入回归方程计算样品中黄芩苷的含量,结果见表2。表2 样品含量测定

  3 讨论

  3.1 提取方法的选择 参考 有关文献[7,8]中黄芩苷的提取方法,本实验先后以50%(体积分数)甲醇、70%(体积分数)甲醇、甲醇为溶剂进行超声提取。结果表明,样品采用70%(体积分数)甲醇超声提取基本完全,且黄芩苷与杂质峰分离度较好。同时考察了不同提取时间(30、40、50 min)对提取效率的影响,结果显示超声40 min时提取率已达最高,超声时间延长而提取率并未提高。因此,确定以70%(体积分数)甲醇为提取溶剂,超声提取40 min。

  3.2 内标物的选择 毛细管电泳有重现性差的缺点,因此采用内标法定量。苯甲酸钠、对氨基苯甲酸以及对硝基苯甲酸在280 nm波长处均有吸收。预实验结果表明,苯甲酸钠在体系中不出峰;对氨基苯甲酸灵敏度低,且出峰时间与黄芩苷过于接近,容易产生干扰;对硝基苯甲酸峰型好,虽出峰时间与黄芩苷接近,但在样品中无干扰,故选其作为内标物。

  3.3 运行缓冲液的选择[9] 黄芩苷极性较强,容易离子化;而在硼砂溶液中,黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子[10],加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液,并通过实验确定其最佳浓度为40 mmol·l-1。

  3.4 采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷含量,与高效液相色谱法相比[1,5,6]具有样品用量少,分析成本低等优点,并减少了对环境的污染,可用于栀子金花丸的质量控制。

【参考文献】
 [1] 国药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[m].北京:

  2.3 方法学考察

  2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品贮备液适量,加甲醇稀释成黄芩苷质量浓度为7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0、52.5 μg·ml-1,内标物质量浓度为25.0 μg·ml-1的溶液。依次重力进样10 s,每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(y),黄芩苷质量浓度(ρ)为横坐标进行线性回归,得回归方程y=0.0350ρ-0.0383,r=0.999 6。表明黄芩苷在7.5~52.5 μg·ml-1范围内线性关系良好。

  2.3.2 精密度试验 取质量浓度为30.0 g·ml-1的黄芩苷对照品溶液,按“2.2”项下电泳条件,连续测定5次,记录峰面积并 计算 rsd值。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.99%,表明仪器精密度良好。

  2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号090741),在0、2、4、6、8、12 h分别重力进样10 s,记录峰面积并计算rsd。结果黄芩苷峰面积的rsd=1.65%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

  2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号090741)的栀子金花丸样品6份,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定。结果栀子金花丸中黄芩苷的平均含量为1.63 mg·g-1,rsd=1.62%(n=6)。表明重复性良好。

  2.3.5 加样回收率试验 精密称取栀子金花丸样品(批号090741)共6份,加入黄芩苷对照品适量,按“2.1.3”项下方法处理并依法测定,计算回收率,结果见表1。栀子金花丸中黄芩苷的平均回收率为96.7%,rsd=2.15%。表1 加样回收率试验

  2.4 样品测定

  取栀子金花丸样品3批,按“2.1.3”项下方法处理后依法测定,记录峰面积,代入回归方程计算样品中黄芩苷的含量,结果见表2。表2 样品含量测定

  3 讨论

  3.1 提取方法的选择 参考 有关 文献 [7,8]中黄芩苷的提取方法,本实验先后以50%(体积分数)甲醇、70%(体积分数)甲醇、甲醇为溶剂进行超声提取。结果表明,样品采用70%(体积分数)甲醇超声提取基本完全,且黄芩苷与杂质峰分离度较好。同时考察了不同提取时间(30、40、50 min)对提取效率的影响,结果显示超声40 min时提取率已达最高,超声时间延长而提取率并未提高。因此,确定以70%(体积分数)甲醇为提取溶剂,超声提取40 min。

  3.2 内标物的选择 毛细管电泳有重现性差的缺点,因此采用内标法定量。苯甲酸钠、对氨基苯甲酸以及对硝基苯甲酸在280 nm波长处均有吸收。预实验结果表明,苯甲酸钠在体系中不出峰;对氨基苯甲酸灵敏度低,且出峰时间与黄芩苷过于接近,容易产生干扰;对硝基苯甲酸峰型好,虽出峰时间与黄芩苷接近,但在样品中无干扰,故选其作为内标物。

  3.3 运行缓冲液的选择[9] 黄芩苷极性较强,容易离子化;而在硼砂溶液中,黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子[10],加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液,并通过实验确定其最佳浓度为40 mmol·l-1。

  3.4 采用毛细管电泳法测定栀子金花丸中黄芩苷含量,与高效液相色谱法相比[1,5,6]具有样品用量少,分析成本低等优点,并减少了对环境的污染,可用于栀子金花丸的质量控制。

【参考文献】
 [1] 国药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[m].北京:

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