作者：李海龙，谭银丰，赖伟永，刘明生，符乃光，张俊清
【摘要】 目的采用高效液相色谱法建立海南胆木药材的指纹图谱,为海南胆木药材的生产提供质量控制方法。方法采用高效液相色谱法, 色谱柱为diamonsil tm c18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长为227 nm；流动相为甲醇-0.10%磷酸水溶液，二元梯度洗脱。结果海南胆木药材指纹图谱中，共有峰相对保留时间与相对峰面积的精密度、重复性和稳定性的rsd均小于3%，符合有关规定。结论所建立指纹图谱可用于海南胆木药材的质量控制。
【关键词】 海南胆木； 高效液相色谱法； 指纹图谱； 质量控制
abstract：objectiveto establish the fingerprint chromatography of hainan nauclea officinalis by hplc and provide the method for quality control of hainan nauclea san hplc method with the diamonsil tmc18 column(250 mm×4.6 mm，5μm) and a mixture of methanol-0.10% phosphoric acid solution(dual gradient elution) as the mobile phase was used. the dectection wavelength was set at 227nm. resultshplc fingerprint chromatography of 10 batches of samples was established. the results showed that this method had a good repeatability and the 8 common peaks had an exclusive properties. conclusionthe fingerprint established can be used for quality control of hainan naucleae officinalis.
key words：hainan naucleae officinalis; hplc ; fingerprint; quality control
胆木为茜草科乌檀属乔木乌檀naudea oftcinalis pierrc ex pitard干燥的茎和根, 具有清热解毒，消肿止痛等功效。在我国已用胆木制成注射液及胆木浸膏片，治疗钩端螺旋体和上呼吸道感染［1］。文献报道［2，3］海南胆木中有效成分为生物碱类,其中异长春花苷内酰胺(isovincosidelactone)含量较高。为确保海南胆木药材生产的质量可控，笔者采用高效液相色谱法，建立了海南胆木药材生物碱类成分的检测方法，通过对海南五指山地区不同栽培地区海南胆木药材的研究，建立其稳定可行的指纹图谱。
1 仪器与试药
waters 515高效液相色谱仪；国家药典委员会2004年a 版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”。色谱纯甲醇，试验用水为纯净水，其他试剂均为分析纯。异长春花苷内酰胺对照品（中国药品生物制品检定所，110831-200302）；胆木药材共10批，采自海南五指山地区栽培地不同区域，经中国医科院兴隆分所陈伟平教授鉴定。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为diamonsil tm c18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长为227 nm；柱温为30℃；流动相为甲醇-0.10%磷酸水溶液，二元梯度洗脱，洗脱时间为70 min， 流速为1.0 ml/min；进样量为20 μl，所有组分在70 min内出峰完毕。梯度洗脱条件见表1。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液制备精密称取异长春花苷内酰胺对照品适量，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶液适量溶解，并定容至刻度，配制成质量浓度大约为160 μg/ml的对照品溶液。表1 梯度洗脱条件（略）
2.2.2 供试品溶液制备取胆木药材0.5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，加入70%乙醇50 ml，称重，于沸水浴中加热回流40 min，放冷，称重，用70%乙醇补足减失的质量，滤过，取续滤液适量，以0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度实验取同一份供试品溶液，连续进样6次，记录其图谱。计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的rsd。 结果表明，rsd分别为0.09% ～0.21%和0.19%～2.55%,均小于3.0%，符合指纹图谱的要求。
2.3.2 稳定性实验取同一份供试品溶液，分别于制备后0, 2, 4, 8, 16, 24 h进样，记录其图谱。计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的rsd。 结果表明，rsd分别为0.06%～0.23%和0.21～2.68%，均小于3.0%,符合指纹图谱的要求。
2.3.3 重复性实验取同一批次的胆木6份,按供试品溶液制备方法制备供试品溶液,分别进样,记录其图谱。计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的rsd。 结果表明,rsd分别为0.08%～0.22%和0.21%～2.94% ,均小于3.0% ,符合指纹图谱的要求。
2.4 指纹图谱的建立、分析与评价
2.4.1 指纹图谱的建立
按照供试品溶液制备方法将10批药材制备成供试品溶液，分别进样检测，测定所有供试品溶液的hplc色谱图。根据10批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值(积分值)和相对保留时间等相关参数,进行分析、比较，制定优化的指纹图谱。见图1。
2.4.2 共有峰确定
根据10批胆木供试品的检测结果，比较色谱图。选择胆木供试液图谱中峰面积较大、峰形较好的色谱峰作为共有峰，共8个(见图2)，其中7号峰为异长春花苷内酰胺（为胆木药材主要成分），其峰面积约占总峰面积70%，峰形稳定，可将该峰作为参照峰。
2.4.3 共有峰相关信息
根据10批胆木样品的色谱图结果，以7号峰作为参照峰，计算各共有峰相对保留时间，结果rsd<2.0%（见表2）。8个共有峰其峰面积总和占总峰面积平均百分比为93%。以参照峰峰面积为基准，计算各共有峰峰面积与参照峰峰面积的比值，共有峰面积比值基本固定。结果见表3。均符合指纹图谱的要求。表2 共有峰相对保留时间（略）表3 共有峰的峰面积与参照峰面积比值（略）
2.4.4 指纹图谱相似度评价
本实验记录了10批海南五指山地区不同区域胆木药材的指纹图谱(见图3)。将测试数据导入国家药典委员会2004年a 版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行数据处理。得到胆木药材指纹峰共有模式r(见图3)；与共有模式比较，10批海南五指山地区不同区域胆木药材的指纹图谱相似度分别为0.994，0.995，0.996，0.995，0.994，0.982，0.990，0.989，0.996，0.998。
3 讨论
3.1 提取溶剂的选择取同样量的海南胆木药材分别采用纯乙醇，70%乙醇，50%乙醇，70%甲醇，50%甲醇进行加热回流提取，并将提取液进行hplc分析。结果表明，以70%乙醇提取液的色谱峰强度最大，故选择70%乙醇为提取溶液。
3.2 检测波长的确定在对供试品溶液进行hplc分析的同时，对紫外检测波长进行了筛选，发现在227 nm处胆木药材各色谱峰分离度较好，且主要活性成分异长春花苷内酰胺有较强的吸收，故选择227 nm作为指纹图谱的检测波长。
3.3 梯度洗脱条件的确定在对供试品溶液进行hplc分析时，分别以甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，同时对这两种流动相进行二元等度和梯度洗脱两种方式的筛选，结果按表1的条件可得到分离度较好的胆木药材图谱。
3.4 相似度分析结果表明，海南五指山地区不同栽培区域的海南胆木药材的相似度很好，品质基本一致。本实验对海南胆木药材指纹图谱的构建进行的初步探索，可以为海南胆木药材的品质评价、质量控制提供检测方法。
【参考文献】
［1］符 建，邝少铁，曾祥周，等.胆木浸膏片的抗炎作用研究［j］.海南大学学报（自然科学版),2002,20 (1) : 54.
［2］宣伟东，卞 俊，陈海生. 胆木生物碱成分研究［j］. 中草药，2007，38（2）：170.
［3］李明慧, 丁 岗, 沈鸣，等.胆木及其制剂中异长春花苷内酰胺的分离鉴定和含量测定［j］.中国天然药物,2006,4(2):104.
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