Micro-RNA(miRNA)是一类由22~23个核苷酸组成的短分子RNA,能在转录和翻译后水平调节各类基因。miRNA广泛作用于细胞生长、发育、代谢、凋亡等多种生物反应进程, 其表达量的改变与多种疾病直接相关[1-2],是近十年来生命科学领域的研究重点和热点之一。利用新的生物学技术与计算机技术探索和发现新的miRNA、研究miRNA表达谱、确定miRNA作用靶标以及研究体内miRNA表达等,是目前miRNA研究的重点,旨在揭示miRNA在生命进程与疾病中起到的重要作用。
肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),起源于肾脏的肾小管或集合管的上皮细胞,具有不同的病理类型,其发病原因还不十分明确[3]。miRNA在肾的正常发育、肾细胞癌病变过程中的作用还没有明确的报道,需要深入研究。笔者利用小分子RNA深度测序技术[4],在培养的人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293中建立了相应的miRNA表达谱,分析与人胚肾细胞正常生长于癌细胞分化过程中特定miRNA的表达差异,为揭示miRNA在相应过程中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293购自中科院上海细胞所。
1.1.2 RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司,DMEM培养基购自GIBCO公司,其他相关生物材料与试剂由国内生物公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞的培养 常规条件培养HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293,37 ℃,5%CO2,DMEM培养基培养。
1.2.2 RNA的提取 提取细胞总RNA前,弃培养基上清,加入PBS洗两次,弃去PBS后,加入Trizol,刮下细胞,按说明书步骤提取细胞总RNA,整个RNA提取过程,在低温或者冰上进行,以减少RNA降解。
1.2.3 小分子RNA的深度测序 提取实验组细胞总RNA跑胶回收30 bp以下小分子RNA,在5’和3’分别加上一对Solexa Adaptor,这些小分子RNA再用Adaptor引物经17个循环的扩增,回收90 bp(小分子RNA+Adaptor)左右片段,送武汉华大基因生物公司测序。
2 结果
2.1 人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1分化不同阶段miRNA表达量变化 人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1分化的不同阶段,多数miRNA表达量(拷贝数)相对恒定,这些表达量恒定的miRNA具有维持正常细胞功能的作用。而miR-16,21,29a/b,27a,424/322簇,99b,374a等miRNA在HRC-DH1细胞分化过程中,表达量下降,降幅超过2倍,miR-368则有两倍以上的表达量增加(表1)。这种表达量变化,与分化时间,即分化程度相关(图1)。
2.2 人胚肾细胞细胞系HEK293不同生长状态miRNA表达量变化 培养人胚肾细胞细胞系HEK293细胞,分别收获正常生长状态、指数生长期和接触抑制期的细胞,提取总RNA进行小分子RNA深度测序。结果显示,不同生长状态下,特有miRNA表达量有显著变化,见表2。在对数生长期状态下,miR-142、16、32、92a、424/322簇、20a、19a、10a等miRNA有两倍以上表达量上升,提示这些miRNA在细胞快速生长过程中起到重要作用。相对于对数生长状态,接触抑制生长状态下的HEK293细胞其miR-142、32、19a、196b和10a等miRNA表达量有一定程度减少,其中miR-142下降幅度超过2倍,见图2。
3 讨论
目前发现的人类miRNA已超过1000种,越来越多的miRNA的确切功能正逐渐被确定。如miR-133a参与肌细胞发育,内皮细胞,血管构造,功能及血管再生等。miRNA同样也参与了复杂的疾病调控,如miR-378,miR-296等调控肿瘤血管生成。心室肥厚、心律紊乱、心力衰竭等心脏疾病中也存在miRNA的调控作用[5],但是miRNA在肾的正常发育、肾细胞癌病变过程中的作用还没有明确的报道。本研究发现,特定miRNA在肾细胞不同生长状态,或不同分化状态下表达量呈现一定规律。如上所述miR-16、21、29a/b、27a、424/322簇、99b、274a等miRNA在HRC-DH1细胞分化过程中,表达量下降,降幅超过2倍,而miR-368则有两倍以上的表达量增加。但其中miR-21、29b、27a、29a、374a在HEK293细胞生长状态下则检测到的拷贝数很低,亦无明显表达量的改变,因此推测这类miRNA可能为与肾癌细胞的分化相关,与人胚肾细胞生长关系不紧密。相反,miR-142、19b、32、92a、20a、19a、196b与10a等miRNA则在人胚肾细胞生长过程中起到一定作用,而在肾癌细胞分化过程中作用不明显。
值得注意的是,miR-16在两组实验里都有显著表达量的改变。miR-16在肾癌细胞分化过程中表达量显著下降,但在人胚肾细胞HEK293生长过程中则表达量大幅上调,显示miR-16在肾细胞生长周期中起到了关键的作用。
临床上肾细胞癌对化疗和放疗均不敏感,现有治疗手段有限,早发现对于治疗及预后有重要意义。本研究通过检测miRNA在人胚肾细胞和人肾细胞癌细胞系中的表达谱变化,明确有意义的特定miRNA的序列,既有助于肾细胞癌早期检测,也为深入研究肾细胞癌的发生机制奠定一定基础。
深度测序技术是最新测序技术之一,能提供文库中分子序列及拷贝数等详细信息。小分子RNA深度测序技术有其精确的测序和拷贝读数的优势,不仅能精确定量已知miRNA的拷贝数,而且能发现新的小分子RNA和新的miRNA;而以往的miRNA的微阵列芯片(miRNA microarray)则只能提供已知miRNA的相对表达量,不仅存在假阳性现象,且不能发现新的miRNA。因此,小分子RNA测序能弥补miRNA microarray的相应不足,逐渐成为主要的miRNA研究工具之一。本研究以人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293为研究对象,精确地提供了肾细胞在分化与生长过程中特定miRNA表达变化信息,可以为相关研究提供直接的数据支持。
除了在结果中所示的miR-21等miRNA可能参与肾癌细胞分化过程,miR-142可能参与人胚肾细胞生长过程外,笔者特别留意到miR-16在肾细胞不同生长分化状态表达量呈现规律性变化。miR-16是人类细胞中非常重要的一种miRNA,发现较早,在不同生理病理条件下在不同细胞状态中表现出不同的功能,如在乳腺癌中,miR-16能下调抑癌基因表达,有助于乳腺癌的发生[6];miR-16亦可加强人类骨髓间质干细胞的分化[7]。本研究数据显示,miR-16可能在肾细胞癌分化过程和胚肾细胞生长过程中起到了关键作用,其调控机制需进一步研究。
参考文献
[1] Barte D RNAs:genomics,biogenesis, mechanism,and function[J]. Cell,2004,116(2):281-297.
[2] 张畅,宁勇.MicroRNA与恶性肿瘤[J].中外医学研究,2012,10(1):159-160.
[3] Maher E cs and epigenomics of renal cell carcinoma[J].Semin Cancer Biol,2012,52(10):1.
[4] Li Y,Zhang Z,Liu F,et mance comparison and evaluation of software tools for microRNA deep-sequencing data analysis[J].Nucleic Acids Res,2012,40(10):4298-4305.
[5] Rottiers V,Nr A NAs in metabolism and metabolic disorders[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2012,13(4):239-250.
[6] Rivas M A,Venturutti L,Huang Y W,et regulation of the tumor-suppressor miR-16 via progestin-mediated oncogenic signaling contributes to breast cancer development[J].Breast Cancer Res,2012,14(3):77.
[7] Liu J L,Jiang L,Lin Q X,et NA 16 enhances differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in a cardiac niche toward myogenic phenotypes in vitro[J].Life Sci,2012,90(25-26):1020-1026.
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