生物研究成果表达(生物学的研究方法ppt)

【摘要】 　　目的: 构建pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 转染cho细胞进行稳定表达, 获得有生物学活性的mox40ig融合蛋白。方法: rtpcr法扩增获得higg1fc段基因, 构建pcdna3.1higg1fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pires2egfpmox40重组质粒中pcr扩增mox40胞外段, 将其插入pcdna3.1higg1fc重组质粒中构建pcdna3.1mox40ig真核表达载体。脂质体法转染cho细胞获得稳定表达, 用rtpcr与elisa法检测其表达, 蛋白a亲和纯化后, sdspage进行鉴定。3htdr掺入法研究ox40信号对b细胞的体外促增殖作用。结果: 测序证实higg1fc段、 mox40胞外段及mox40ig基因序列正确, rtpcr与elisa证实mox40ig的表达, sdspage证实其为mox40ig融合蛋白, 3htdr掺入法显示mox40ig在体外能有效地促进b细胞增殖。结论: 成功地构建pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 并获得有生物学活性的mox40ig融合蛋白的稳定表达, 为进一步开展ox40相关领域的横向应用研究奠定了基础。

【关键词】 ox40 mox40 ig cho细胞 真核表达

　　[abstract] aim: to construct a recombinant eukaryotic expression vector containing pcdna3.1mox40ig fusion gene and obtain mox40ig fusion protein with bioactivity by transfecting cho cells. methods: the gene fragment encoding the human igg1fc was amplified by rtpcr and the eukaryotic expression vector pcdna3.1higg1fc was constructed. after sequencing, mox40 extracellular gene was cloned from pires2egfpox40 by pcr and then inserted into the recombinant vector pcdna3.1higg1fc. the right recombinant was transfected into cho cells with lipofectin ragent and its expression was detected by rtpcr and sandwichelisa. after purified by protein a affinity column chromatography, the mox40ig fusion protein was identified by sdspage and its effect on the proliferation of b cells in vitro was studied by 3htdr method. results: the higg1fc, mox40 extracellular gene and mox40ig gene were consistent with dna expression of mox40ig fusion protein in cho cells was confirmed by rtpcr, sandwichelisa and sdspage. 3htdr analysis showed the mox40ig fusion protein stimulated the proliferation of b cells in vitro. conclusion: a eukaryotic expression vector containing pcdna3.1mox40ig has been constructed successfully and the stable expression of mox40ig fusion protein with bioactivity has been acquired, which lays a solid basis for further study of the application related to ox40.

　　[keywords]ox40; mox40ig; cho cell line; eukaryotic expression

　　ox40/ox40l作为免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子, 对延长t细胞的寿命、 促进其增殖[1, 2]、 刺激dc细胞的分化成熟[3]、 促进生发中心的形成均有重要的作用[4]。本研究我们通过构建pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 将其转染cho细胞, 获得可溶性mox40ig融合蛋白的稳定表达, 并进行初步的鉴定和生物学活性检测, 为进一步研究ox40分子在肿瘤免疫、 自身免疫性疾病中的作用奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 trizol购自gibco公司; mmlv第1链cdna合成试剂盒、 taq dna聚合酶、 各种限制性内切酶及t4连接酶均购自mbi公司; agarose（西班牙分装）购自上海生工公司; lipofectin reagent购自invitrogen公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。g418购自北京华美公司。蛋白a亲和层析柱购自本元正阳公司。羊抗人igg、 正常人igg、 hrp标记鼠抗人iggfc购自宁波新芝生物公司。小鼠migm激发型抗体及抗cd40激发型单克隆抗体(mab)购自r&d公司。 3htdr购于中国原子能科学研究院。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物的设计与合成 根据genbank中登录的人igg1fc段及小鼠ox40胞外段 cdna序列, 利用引物设计软件primer premier5.0进行引物设计, 全部引物由上海生工合成。higg1fc段上、 下游引物p1、 p2为: 5′cggaattcacttgcccaccgtgcccag3′, 含ecor i的酶切位点, 5′ccgctcgagtcatttacccggagacagggag3′, 含xho i的酶切位点。小鼠ox40胞外段上、 下游引物p3、 p4为: 5′cgggatccaagatgtatgtgtgggttcag3′, 含bamh i的酶切位点, 5′cggaattcaggtccctcaggagtcac3′, 含ecor i的酶切位点。

　　1.2.2 rtpcr法扩增higg1fc段基因 ficoll密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞后, 按trizol试剂盒说明书抽提总rna。rtpcr反应体系为20 μl: 在冰浴的eppendorf管中依次加入总rna 5 μl, 随机引物1 μl和无rna酶去离子水6 μl, 轻轻混匀后70℃水浴5 min 置冰上, 再加入5×reaction buffer 4 μl, rnaseinhibitor(200万u/l) 1 μl及dntp mix(10 mmol/l) 2 μl, 轻轻混匀后37℃水浴5 min, 再加入1 μl revertaidtmmmulv逆转录酶(200万u/l), 反应混合物在25℃温育10 min后, 37℃水浴60 min, 再70℃加热10 min结束反应后, 冷冻保存于-20℃备用。以上述逆转录cdna为模板, p1、 p2为上下游引物扩增higg1fc段基因, 反应条件为: 95℃预变性5 min后, 以94℃变性1 min, 56℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 为1个循环, 共32个循环, 最后再于72℃延伸10 min。

　　1.2.3 重组pcdna3.1higg1fc的构建 higg1fc段pcr产物纯化后与pcdna3.1载体分别经ecor i和xho i双酶切37℃, 4 h, 65℃水浴灭活20 min, 割胶回收酶切后的目的片段, 连接转化感受态细菌; 筛选阳性克隆经质粒pcr、 限制性酶谱分析及测序分析确证。

　　1.2.4 pcr法扩增小鼠ox40胞外段 以本室构建鉴定并保存的pires2egfpox40重组质粒为模板, 以p3、 p4为上下游引物扩增小鼠ox40胞外段基因, 反应条件为: 95℃预变性5 min后, 94℃变性55 s, 55℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 为1个循环, 共30个循环, 最后再于72℃延伸10 min。

　　1.2.5 真核表达载体pcdna3.1mox40ig的构建 小鼠ox40胞外段pcr产物纯化后与测序正确的pcdna3.1higg1fc重组质粒分别用bamh i和ecor i进行双酶切, 37℃, 4 h后置65℃灭活20 min, 16℃连接过夜, 转化感受态dh5α菌株, 筛选阳性克隆即重组真核表达载体pcdna3.1mox40ig; 重组质粒分别经质粒pcr、 限制性酶谱分析及测序分析证实。

　　1.2.6 表达mox40ig的cho细胞株的构建及稳定转染 将pcdna3.1mox40ig重组质粒以脂质体法转染96孔板中已70%～80%融合的cho细胞。转染48 h后, 置于含g418的选择培养液中, 筛选培养2周后再用有限稀释法挑取阳性克隆。

　　1.2.7 rtpcr检测外源ox40ig mrna的表达 收集g418抗性细胞, trizol法抽提总rna, 逆转录获得cdna后分别以p3+p4、 p3+p2、 p1+p2为上下游引物进行pcr扩增, 琼脂糖电泳测定扩增产物。

　　1.2.8 夹心elisa法检测上清中mox40ig融合蛋白的表达 用10 mg/l的羊抗人igg包被酶标板, 酶标抗体为hrp标记鼠抗人iggfc mab, 同时以正常人igg为阳性对照, 以转染有pcdna3.1空载体的细胞培养上清为阴性对照。

　　1.2.9 蛋白a亲和层析柱纯化及纯化蛋白的鉴定 样品的纯化按说明书进行。sdspage完毕后以考马斯亮蓝g250染液染色, 鉴定纯化后mox40ig融合蛋白的分子量。

　　1.2.10 小鼠b淋巴细胞的制备 小鼠眼球放血处死, 无菌取脾脏, 移入滤网中研磨, 用ficoll分离单个核细胞。pbs洗后, 贴壁2 h去除贴壁细胞, 吸出富集的b细胞备用。

　　1.2.11 淋巴细胞增殖试验 将反应b细胞按1×105个/孔的浓度加到预先用抗小鼠migm激发型抗体（1 mg/l）包被的96孔板中, 同时加入或不加入抗小鼠cd40激发型抗体（1 g/l）。培养2 d后, 分别加入1∶10、 1∶20、 1∶40倍比稀释的纯化 mox40ig, 同时设阴性对照（不同浓度的人igg）, 空白对照（含100 ml/l fcs 的rpmi1640培养液）, 每组设5个复孔。在37℃、 50 ml/l co2培养箱中共培养2 d, 加入3htdr(0.5μci/孔), 于37℃共育16h。将细胞收集于24nm玻璃纤维纸片上, 使用β液体闪烁计数器测定每个样品的cpm值。

　　1.2.12 统计学处理 采用sas8.0软件对数据进行单因素方差分析和多元方差分析。

　　2.1 higg1fc段基因的扩增及重组载体pcdna3.1higg1fc的构建 rtpcr法从正常人外周血单个核细胞中扩增出约650 bp的higg1fc段基因（图1）, 重组载体经pcr、 限制性酶谱分析后（图2）进行dna测序。结果显示, 所获得的higg1fc段基因序列与genbank中报道的序列完全一致。

　　图1 rtpcr法扩增人igg1fc段基因电泳检测（略）

　　fig 1 the agarose electrophoresis of rtpcr product of human igg1fc gene

　　1: dna marker; 2: cdna fragment encoding the human igg1fc; 3: βactin.

　图2 重组载体pcdna3.1higg1fc的酶切鉴定（略）

　　fig 2 results of recombinant pcdna3.1higg1fc digested by ecor i plus xho i

　　1: dna marker; 2: pcdna3.1higg1fc/ecor i+xho i; 3: pcdna3.1; 4: pcdna3.1higg1fc.

　　2.2 小鼠ox40胞外段的扩增及真核表达载体pcdna3.1mox40ig的构建 pcr法扩增获得的小鼠ox40胞外段基因约690 bp左右（图3）, 重组真核表达载体pcdna3.1mox40ig经质粒pcr（图4）、 限制性酶谱分析（图5）后进行dna测序。结果显示, 所获得的小鼠ox40胞外段及higg1fc段基因序列均与genbank中报道的序列完全一致, 并且拼接后的小鼠ox40胞外段及higg1fc段基因未发生移码突变。

　　图3 pcr扩增小鼠ox40胞外段基因电泳检测（略）

　　fig 3 amplification of mouse ox40 extracellular gene by pcr

　　1: dna marker; 2: mouse ox40 extracellular gene.

　　图4 重组载体pcdna3.1mox40ig的pcr鉴定结果（略）

　　fig 4 pcr analysis of recombinant pcdna3.1mox40ig

　　1: the human igg1fc gene; 2: dna marker; 3: mouse ox40 extracellular gene; 4: mox40＋higg1fc.

　　图5 重组载体pcdna3.1mox40ig的酶切鉴定（略）

　　fig 5 restrictive enzyme digestion analysis of recombinant pcdna3.1mox40ig

　　1: λdna/ecor i+hind iii marker; 2: pcdna3.1mox40ig; 3: pcdna3.1mox40ig/ecor i+xho i; 4: pcdna3.1mox40ig/bamh i+xho i; 5: pcdna3.1mox40ig/hind iii+xho i; 6: dna marker.

　　2.3 mox40ig的表达、 纯化及鉴定

　　2.3.1 rtpcr检测 将鉴定正确的pcdna3.1mox40ig以脂质体法转染cho细胞, 经g418筛选获得稳定表达mox40ig的细胞株。rtpcr鉴定表明, 从cho/mox40ig细胞中能扩增出小鼠ox40胞外段（约650 bp）、 higg1fc（约690 bp）及mox40ig（约1330 bp）特异性条带; 而转染pcdna3.1的细胞样品未扩增出特异性条带（图6）。

　　图6 稳定表达mox40ig的cho的rtpcr鉴定（略）

　　fig 6 identification of mox40ig stably expressed cho by rtpcr

　　1: dna marker; 2-4: the cho cells transfected with pcdna3.1mox40ig; 5: the cho cells transfected with pcdna3.1.

　　2.3.2 转染细胞上清的双抗体夹心elisa法检测结果 为了检测上清中是否有mox40ig融合蛋白的表达, 我们建立了一种针对mox40ig融合蛋白中fc段的夹心elisa检测法。阴性对照为转染有pcdna3.1空载体的细胞培养上清, 阳性对照为纯化的人igg。结果显示: 阳性转染细胞上清与阳性对照的a490值接近, 其与阴性对照组及空白调零组（pbst）的差异均有统计学意义（p<0.01）。我们认为据此可初步判定上清中有目的蛋白—可溶性mox40ig融合蛋白的表达。取1次收集的上清原液作一系列倍比稀释后夹心elisa检测结果如图7所示。

　　图7 夹心elisa检测mox40higg1fc的表达（略）

　　fig 7 confirmation of the fusion protein mox40ig expression by sandwich elisa assay

　　2.3.3 mox40ig融合蛋白表达的sdspage鉴定 收获pcdna3.1mox40ig转染cho细胞培养上清, 经蛋白a纯化后, 取20 μl在还原条件下进行sdspage分析, 结果显示: 在还原条件下, 转染有pcdna3.1mox40ig的细胞上清纯化后可见有一mr位于66.2 ×103～43×103之间的特异性蛋白带（图8）, mox40ig融合基因编码434个氨基酸, 切除可能的含19个氨基酸的信号肽后, 还剩415个氨基酸, mr 46.3×103（单体且未糖基化时）。考虑到真核表达过程中糖基化对分子量的影响, 可认为与估计的mr 46.3×103基本相符。

　　2.4 mox40ig融合蛋白对b细胞的体外促增殖作用 mox40ig融合蛋白能有效促进b细胞增殖, 说明我们获得了有生物学活性的mox40ig融合蛋白, 并且随着其浓度的增高, 促增殖效应越明显, 但其作用强度不如抗cd40 mab明显（p<0.05）, 两者联合应用的促增殖效应较单独应用mox40ig融合蛋白或抗cd40 mab均具有统计学意义（p<0.05, 图9）。

　　图8 mox40ig融合蛋白的sdspage鉴定（略）

　　fig 8 identification of relative molecular weight of the fusion protein mox40ig

　　图9 mox40ig对小鼠b细胞的体外促增殖作用（略）

　　fig 9 the influence on b cell proliferation stimulated with mox40ig in vitro

　　3 讨论

　　ox40/ox40l是免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子, 它们的相互作用能促进cd4+t细胞的活化、 增殖、 迁移, 延长其寿命, 并促进生发中心的形成和dc的分化成熟。ox40（cd134）, 是tnfr超家族成员之一, 为i型跨膜糖蛋白, 属活化后诱导表达, 即只表达于活化的t细胞表面, 且主要是cd4+t细胞, cd8+t细胞表面有少量表达[5]。表达ox40的t细胞只在炎症处存在, 其阳性t细胞是抗原特异性t细胞, 在外周血中不存在, 其表达时相较晚且短暂, 这些特点成为其治疗由t细胞介导的多种自身免疫性疾病及防治移植排斥的有利条件。除此之外, 在对免疫耐受影响的研究中发现, 许多共刺激分子都可以阻止耐受的形成, 而耐受一旦形成, 只有ox40可以打破已建立的外周耐受[6], 从而可以打破肿瘤的免疫耐受, 恢复免疫监视。以往研究显示, ox40/ox40l在机体的免疫应答和多种疾病中均起重要作用, 而通过对ox40及其配体相互作用的干预可能是治疗多种人类疾病的有效途径之一[7]。

　　有研究显示, ox40胞外段与各种igg的fc段融合构建的融合蛋白中, 与igg1的fc段融合所构建的融合蛋白与ox40l结合的亲和力最强[8]。本研究中, 我们将ox40胞外段与igg1fc段融合构建了pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 转染cho细胞后, 经rtpcr、 双抗体夹心elisa及sdspage分析证实我们获得了mox40ig融合蛋白的分泌性表达。同时, 我们对mox40ig融合蛋白的功能进行了初步的体外研究。 3htdr掺入试验表明, 分泌表达的mox40ig融合蛋白能够明显促进b细胞增殖, 若将其与抗cd40 mab共同作用于b细胞, 其促增殖作用更为明显。本研究中我们成功地构建了pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 将其转染cho细胞, 获得了可溶性mox40ig融合蛋白的稳定表达, 并进行了初步的鉴定和生物学活性检测, 为进一步研究ox40分子在移植耐受的诱导及自身免疫病治疗中的作用打下良好的基础。

【参考文献】
　　[1] huddleston ca, weinberg ad, parker dc. ox40 (cd134) engagement drives differentiation of cd4+t cells to effector cells[j]. eur j immunol, 2006, 36(5): 1093-1103.

　　[2] mendel i, shevach em. activated t cells express the ox40 ligand: requirements for induction and costimulatory function[j]. immunology, 2006, 117(2): 196-204.

　　[3] wang yh, ito t, wang yh, et al. maintenance and polarization of human th2 central memory t cells by thymic stromal lymphopoietinactivated dendritic cells[j]. immunity, 2006, 24(6): 827- 838.

　　[4] 原江水, 冯永堂, 王 菲, 等. 小鼠ox40稳定表达细胞株的构建及其对b细胞促分化作用的研究[j]. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21（6）: 767-771.

　　[5] song a, song j, tang x, et al. cooperation between cd4 and cd8 t cells for antitumor activity is enhanced by ox40 signals[j]. eur j immunol, 2007, 37(5): 1224-1232.

　　[6] bansal p, jember ag, groft m. signaling through ox40(cd134) breaks peripheral tcell tolerance[j]. nat med, 2001, 7(8): 907-912.

　　[7] hori t. roles of ox40 in the pathogenesis and the control of diseases[j]. int j hematol, 2006, 83(1): 17-22.

　　[8] taylor l, schwarz fication of a soluble ox40 isoform: development of a specific and quantitative immunoassay[j]. immunol methods, 2001, 255(1-2): 67-72.