microRNA是一类大小约22个核苷酸长度的内源性非编码小分子RNA[1]，主要通过识别并结合靶基因 mRNA 的3’端非编码区，在转录后水平抑制蛋白的翻译或促进靶基因的降解[23]。有研究发现微小RNA参与肺内炎症反应的调控[4]，miR146a是其中较有代表性的一个。本课题组前期研究发现，用LPS刺激肺泡巨噬细胞，miR146a的表达水平升高，并且升高程度与TNFα mRNA呈负相关[5]；转染miR146a能下调LPS诱导肺泡巨噬细胞TNFα的表达[6]，表明miR146a能抑制LPS诱导肺泡巨噬细胞的炎症反应。本实验拟进一步探讨miR146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制，为体内试验提供理论依据。
1 材料和方法
11 材料
大鼠肺泡巨噬细胞NR8383（上海中国科学院细胞库）；LPS（ 0111：B4）；PremiRTM miR146a前体、CyTM3标记的PremiRTM阴性对照（美国ABI公司）；大鼠 TNFα ELISA 检测试剂盒（上海森雄科技实业有限公司） ； PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR荧光染料试剂Ⅱ（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ）PCR 检测试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；抗IRAK1 抗体，抗TRAF6 抗体、抗NFκB p65抗体（美国abcam公司）。
12实验分组及处理
将体外培养的 NR8383 细胞按每孔15×106个接种至6孔板，每孔2 mL，每组2个复孔。转染组转染50 nmol/L的PremiRTM miR146a前体，对照组转染50 nmol/L 的 CyTM3 标记的 PremiRTM 阴性对照，摇匀后继续培养24 h，随后加入1 μg/mL 终质量浓度的 LPS 处理细胞6 h，离心收集细胞和上清液，-80 ℃保存。
13检测指标及方法
131免疫荧光法观察 NFκB p65 核移位情况将细胞爬片放置于24孔板；甲醇丙酮固定细胞，05%TritonX100 PBS 透化细胞；再放入含10%驴血清的 PBS 中4 ℃封闭；孵育一抗：用05%TritonX100 PBS稀释兔抗 NFκB p65（1∶50），常温下孵育4 h后漂洗；孵育二抗：用10%驴血清的 PBS 稀释 Alexa Flour 488 驴抗兔绿色荧光标记二抗（1∶200），室温下孵育20 min后漂洗；用 Dapi 染核，滴加防荧光粹灭剂、固定封片，在Olympus IS71倒置荧光显微镜下拍照分析。
132ELISA 检测 TNFα 蛋白含量收集细胞上清液，按照 ELISA 试剂盒操作说明书步骤操作检测 TNFα 蛋白含量。
133RTqPCR 检测 IRAK1、TRAF6 及TNFα mRNA 表达采用 TRIzol 法提取细胞内总 RNA，通过紫外分光光度计测定总 RNA 浓度，琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 完整性及纯度。按照 PrimeScript逆转录试剂盒说明书操作，所有操作均在冰上完成。10 μL 的逆转录反应体系：PrimeScript 缓冲液 2μL，PrimeScript 逆转录酶复合物 105 μL，多聚胸腺嘧啶引物 05 μL，随机的6核苷酸引物 05 μL，总RNA 500 ng，加无核酶水至总体积10 μL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。20 μL 的 PCR反应体系包括：cDNA 2 μL，上游引物 08 μL，下游引物 08 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye 04 μL，无核酶水6 μL。反应条件：95 ℃ 30 min，40个扩增循环（95 ℃ 5 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 27 s）。选取βactin 作为内参，检测IRAK1 mRNA、TRAF6 mRNA及TNFα mRNA的表达，相对表达量采用2ΔΔCt计算。引物序列及长度见表1。
134IRAK1、TRAF6、NFκB p65 蛋白表达收集细胞，离心，弃上清，提取总蛋白或分别提取胞核蛋白、浆蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。完成聚丙烯酰胺凝胶电泳（每孔加样20 μL）、转膜、封闭，孵育一抗，兔抗 IRAK1（1∶2000）、兔抗 TRAF6 （1∶1000）、兔抗 NFκB p65（1∶500）和鼠抗 βactin（1∶3000）/兔抗 Lamin B1（1∶1000），4 ℃孵育过夜，漂洗3次；孵育二抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 、山羊抗鼠 IgG（1∶4000），37 ℃孵育12 h，漂洗3次，暗室内曝光、显影并定影，行X胶片扫描，通过 Quantity One 软件进行数据分析，检测 IRAK1、TRAF6及胞浆NFκB p65蛋白以 βactin 作为内参，细胞核内NFκB p65蛋白以 Lamin B1作为内参。
14统计学方法 采用 SPSS 170 统计软件分析数据，数据以均数±标准差（x±s）表示，两样本比较采用独立样本t检验。以P<005为差异具有统计学意义。
2结果
21过表达 miR146a 对 LPS 诱导的 NR8383 细胞 NFκB p65 核移位的影响
211免疫荧光法观察细胞 NFκB p65 核移位的变化倒置荧光显微镜下观察到NFκB p65 呈绿色荧光，Dapi 染核后呈蓝色荧光。与对照组比较，观察到转染组 NFκB p65 胞核中表达减少，胞浆中增多。
23过表达 miR146a 对 LPS刺激的NR8383细胞 IRAK1和TRAF6蛋白表达的影响
与对照组比较，过表达miR146a后，转染组IRAK1 mRNA增加为（116± 01）倍，TRAF6 mRNA增加为（119± 016）倍，差异均无统计学意义（P>005）；转染组IRAK1 蛋白下降为（073±005）倍，TRAF6 蛋白下降为（064±009）倍，差异均有统计学意义（P<005）。见图4。
3讨论
miR146a 是第一个被发现能够调节免疫系统的微小RNA，当机体存在有感染、肿瘤时miR146a 表达上调[79]，上调人单核细胞白血病细胞（THP1细胞）的 miR146a 后将负性调控炎症因子的释放[10]。研究证实在 LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中 miR146a 表达上调；本研究发现过表达 miR146a 后，用 LPS 刺激肺泡巨噬细胞， NFκB 核移位受到抑制，TNFα mRNA 表达下降，上清液中 TNFα 蛋白含量也明显下降，提示 miR146a 能够抑制 LPS 诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应。
A：RTqPCR检测过表达miRNA146a后NR8383细胞中IRAK1和TRAF6 mRNA的表达变化；B：Western bloting 检测过表达miRNA146a后NR8383细胞中IRAK1和TRAF6蛋白的表达变化；C：Quantity One 软件对B图条带进行灰度值分析，与对照组比较， aP<005
笔者进一步实验发现，过表达 miR146a 后，IRAK1 mRNA 和 TRAF6 mRNA 表达量无明显变化，而 IRAK1 和 TRAF6 蛋白表达下降。Taganov 等[11]研究发现 LPS 刺激 THP1 细胞后，miR146a 表达上调，并通过突变试验和荧光素酶报道基因试验证实，miR146a 的靶基因是 TLRs/NFκB 通路中的两个接头蛋白编码基因 IRAK1和TRAF6。TLRs/NFκB 是经典的炎症信号通路，当LPS 刺激肺泡巨噬细胞，可与细胞膜表面 TLR4 结合，导致 IRAK1 自身磷酸化，继而活化 TRAF6，使其与转化生长因子 β活化激酶1（TAKl）及 TAKl 的结合蛋白（TAB）形成复合物，导致 IκB 磷酸化和降解，最终使 NFκB 移位进入核内，启动相关基因转录翻译生成 TNFα 炎症因子[1213]。有研究表明过表达 IRAK1 能够使 HEK293 细胞和 THP1 细胞中NFκB 呈剂量依赖性增加，同时 TNFα 也增加，而敲除 IRAK1 基因能降低 LPS 诱导的 THP1 细胞[1415]炎症反应；同样过表达或者敲除 TRAF6 也产生相同的作用。
参考文献
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