作者：张延莹，张金巍，张培，刘岩
【摘要】 目的利用近红外光谱（nir）技术研究并建立丹酚酸b的含量检测模型，实现产业化规模中药生产纯化过程的在线质量监控。方法在线采集近红外光谱，同时进行丹酚酸b的hplc检测，采用偏最小二乘法建立纯化过程的丹酚酸b含量检测模型。结果模型的最佳建模波段为9 815～5 430 cm-1，相关系数r=0.977 6，校正均方差rmsec=4.02。预测值与真实值的平均相对误差<5%。结论利用nir技术能够实现丹酚酸b纯化过程的在线质量监控。
【关键词】 近红外； 高效液相色谱法； 丹酚酸b； 在线质量监控； 生产规模
我国现行中药生产工艺的控制模式很少考虑工艺过程中的成分及含量变化，基本仍停留在传统的经验控制方法上；同时产品的离线检测方法无法适应生产过程在线检测的需要。实现生产过程的在线实时质量监控是保证中药质量稳定、均一的关键，也是实现中药生产现代化的技术瓶颈。近红外光谱（near infrared, nir）是近年来迅速发展的一种快速分析技术，它是被测样品的物质组成与结构信息的间接体现。样品nir光谱的获取操作简便且成本低，无须复杂的样品前处理，符合在线检测的要求。随着化学计量学和计算机技术的发展，nir技术在农业和石油工业领域得到了广泛应用［1，2］ 。2002年，美国fda把该项技术作为一种标准的检测方法，2005版《中国药典》已将“近红外分光光度法指导原则”列入目录［3］ 。近年来，nir技术在中药行业特别是中药生产过程的在线检测逐渐成为研究热点，有学者应用其检测丹参水提过程丹参酮和丹酚酸b的含量［4］ ，也有对栀子药材提取和三七总皂苷模拟物系进行实时定量分析［5，6］ ，最近还有应用nir技术对黄连和枳壳提取物的纯化过程进行快速分析的报道［7，8］ ，但这些仅局限于实验室规模的模拟生产研究，基于生产规模的中药纯化过程的近红外在线检测技术的研究还未见报道。
本研究以产业化生产丹酚酸b的关键工序—纯化过程作为研究系统，以洗脱液中的主要有效成分-丹酚酸b的含量变化作为研究对象，利用nir在线检测技术采集光谱，并结合hplc检测技术和化学计量学的数据处理方法，建立纯化过程的丹酚酸b含量检测模型，实现生产过程的全程实时质量监控。
1 仪器与材料
1．1 仪器
antaris 傅立叶近红外分析仪（美国 thermo公司），配有光纤配件及tq analyst 分析软件；agilent 1100高效液相色谱仪（美国hp公司）；150l不锈钢层析装置（天士力现代中药资源有限公司）。
1．2 材料
丹参（陕西商洛），经天士力现代中药资源有限公司质检部鉴定为丹参salvia miltiorrhiza bge；丹酚酸b对照品（中国药品生物制品检定所）；甲醇、乙腈为色谱纯（默克公司）；甲酸为分析纯（天津化学试剂有限公司）。
2 原理与方法
2．1 原理近红外光是介于可见光和中红外光之间的电磁波，美国材料检测学会将近红外光谱区的范围定义为780～2 526 nm(12 820～3 959 cm-1)［9］ ，是人们最早发现的非可见光。它的光谱区与有机分子中含氢基团（oh、nh、ch）振动的合频和各级倍频的吸收区相一致，通过扫描样品的近红外光谱，可以得到样品中有机分子含氢基团的特征信息。不同基团或同一基团在不同化学环境中的近红外吸收波长与强度都有明显差别。因此近红外光谱具有丰富的样品结构和组成信息，适用于天然产物活性成分的品质检测［10］ 。由于近红外光谱吸收谱带较宽且重叠严重，必须使用化学计量学方法提取近红外光谱特征信息［11］ 。本研究以hplc确定待测组分的含量，应用偏最小二乘法（pls）建立组分含量与nir光谱间关系的数学模型，实现对丹酚酸b生产过程的在线检测和质量监控。
2.2 方法
2.2.1 建立研究系统称取丹参药材共50 kg，置于500 l提取罐中，加5.5倍量水，煎煮提取1 h，放液；药渣进行第2次提取，加入3倍量水，煎煮提取0.5 h，放液。提取液混合并经过处理后，用聚酰胺树脂纯化，流速为1bv/h。在纯化过程中每隔一定时间在线采谱1次，同时取样进行hplc检测。
2.2.2 nir谱图的在线采集
光谱采集方式：对纯化过程每隔2～5 min采谱1次，每次采集2张谱图；采谱的同时取样进行hplc检测，样品编号一一对应。
光谱采集条件：扫描范围：10 000～4 000 cm-1，扫描次数32，分辨率8 cm-1。丹参洗脱液的近红外谱图参见图1。
在谱图采集过程中，流通池中的样品存在气泡，一直是困扰试验进行的大问题，因为其直接影响到光信号在流通池中的吸收与传播，造成采集到的光谱出现不规则峰型，谱图信息受到严重干扰。针对该问题，作者从设备、现场操作等方面入手，经过试验和摸索，避免了气泡的干扰现象，扫清了在线采谱的最大障碍。
2.2.3 丹酚酸b含量的hplc测定方法
色谱条件：色谱柱为agilent zorbax sb-c18（5 μm, 4.6 mm×250 mm）；流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水=30∶10∶1∶59；检测波长286 nm；流速1 ml/min；柱温30℃；进样量5 μl。
对照品溶液的制备：精密称取丹酚酸b对照品适量，加75%甲醇制成浓度约为0.14 mg/ml的溶液。
供试品溶液的制备：精密量取适量洗脱液，用75%甲醇稀释至10 ml，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取滤液即得。
3 结果
3.1 光谱数据的预处理在近红外光谱的采集过程中，环境的变化会引起光谱的基线偏移，随机噪声和样品背景干扰都会对校正结果产生影响，因此需要对光谱数据进行预处理。本研究将各种光谱预处理方法排列组合，考察其对纯化模型相关系数(r)、均方差(rmsec)及内部交叉验证均方差(rmsecv)的影响。结果见表1。
使用的预处理方法有多元散射校正（msc）、标准正交变换（snv）、一阶微分(fd)、二阶微分(sd)、savitzky-gdcey滤波平滑（s-g）和norris导数滤波平滑(norris)等。根据表中的计算结果，最终选择fd+norris的光谱预处理方式建立模型。
3.2 最佳主因子数的选择采用pls法建立定量模型时，为避免出现“过拟合”现象，需要对主因子数进行合理选择。本研究采用留一交叉验证法［12］，考察了主因子数对内部交叉验证均方差（rmsecv）的影响。模型的交叉验证结果见图2。
从图2中可以看出，当主因子数为6时，rmsecv为4.42，超过此主因子数时，rmsecv不下降反而有所上升，因此确定最佳主因子数为6。
3．3 光谱范围的选择光谱范围的选择在nir定量分析模型的建立中是最难的一步。迄今为止，化学计量学领域还没有一个完美的算法来选择最佳的光谱范围。本研究在去除吸收饱和波段及噪声较大的部分波段后，通过比较，选取吸收特征较为明显的9 815～5 430 cm-1波段作为建立模型的最佳光谱范围，模型的相关系数及预测效果良好。表1 不同光谱预处理方法对纯化模型的影响（略）
3.4 模型的建立本研究对6批次丹酚酸b纯化过程的251个实验样本进行数据分析，采用一阶微分光谱对丹酚酸b含量进行pls建模。根据交叉验证获得的结果如下：最佳主因子数为6，相关系数r=0.977 6，rmsec=4.02。模型预测值与真实值的相关系数图见图3。
3.5 预测效果的评价为了验证上述模型的预测效果，参照同样的生产条件，重复进行1批次生产，采集纯化样本33个，用于模型的验证。丹酚酸b含量的预测值与真实值的变化趋势见图4。
从图4可以看出，剔除个别异常数据点，纯化过程的预测曲线与真实曲线呈现稳定、一致的变化趋势，预测值与真实值之间的平均相对误差为4.8%。异常数据点的形成可能有如下几个原因：首先近红外仪器要求待测组分含量不能低于0.1%，目标组分的含量过低会给检测带来较大误差；同时，考虑到本研究采用在线采谱的方式，液体在管路中一直是处于不断运动的状态，其通过流通池时的流动稳定性以及气泡问题，会导致部分数据失真，增大了预测误差。
4 讨论
近红外光谱分析技术具有方便、省时、成本低、环境良好等优点。本研究以产业化规模的丹酚酸b纯化过程作为研究对象，采用直接在生产装置上进行在线采谱的方式，建立了丹酚酸b含量检测模型，模型的趋势预测效果良好，能够满足生产过程中在线检测和质量监控的要求。
光谱的预处理方法、光谱范围及主因子数的选择对所建模型的精确度影响很大，应对各种条件进行分析对比，以选择最优的建模参数。
待测组分含量低于近红外仪器检测限、液体在管路中流动状态的稳定性，以及流动过程中气泡的存在都会干扰谱图信息的采集，影响模型的预测效果。在实际在线检测过程中应采取有效措施，减少上述情况的发生。
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