【关键词】 血管紧张素ⅱ; 5-氮杂胞苷; 骨髓间充质干细胞;心肌样细胞
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【摘要】 目的 观察血管紧张素ⅱ联合5-氮杂胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞 (bmmscs) 定向分化为心肌样细胞的作用。方法 采用密度梯度离心法分离大鼠bmmscs,取第3代bmmscs进行分组诱导:血管紧张素ⅱ组(angⅱ，终浓度为0.1μmol/l)、5-氮胞苷组 (5-aza,终浓度为10μmol/l)、angⅱ联合 5-aza组 (终浓度分别为0.1μmol/l与10μmol/l)、空白对照组。诱导24h后更换常规培养液继续培养 4 周。倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化，mtt法检测细胞活性及增殖能力，免疫荧光染色法鉴定诱导后bmmscs中心肌特异性肌钙蛋白 i (ctni) 的表达，流式细胞计数法计算心肌样细胞诱导率， 透射电镜观察诱导后心肌样细胞的超微结构。结果 原代培养的bmmscs14天形成集落， 传代细胞体积变大， 诱导后细胞呈长梭形，呈一致性生长， 并出现肌岛样结构。法显示angⅱ联合 5-aza组细胞增殖能力优于angⅱ组与5-氮胞苷组。免疫荧光染色结果显示诱导后bmmscs 表达心肌特异性蛋白ctni。流式细胞计数法显示：angⅱ组、5-aza 、angⅱ联合 5-aza组心肌样细胞诱导率分别为(25.3±2.2)%、(24.6±1.9)%、(30.0±1.7)%，angⅱ联合 5-aza组心肌样细胞诱导率高于angⅱ组与5-氮胞苷组(p>0.05)。透射电镜可见平行排列的肌丝、z线样物质。结论 血管紧张素ⅱ联合5-氮杂胞苷可在体外诱导大鼠bmmscs定向分化为心肌样细胞，其诱导分化率高于单纯5-氮杂胞苷诱导。
【关键词】 血管紧张素ⅱ; 5-氮杂胞苷; 骨髓间充质干细胞;心肌样细胞
angiotensinⅱ and 5-azacytidine induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells
xing yu-jie,lv an-lin,wang li,et ment of cardiology，xijing hospital，fourth military medical university of chinese pla，xi'an 710032,china
[abstract] objective to observe the effect of the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(bmmscs) into cardiomyocyte-like cells with 5-azacytidine and angiotensinⅱ.methods bmmscs were isolated from bone marrow of sd mouse by density gradient centrifugation. the third passage cells were divided into four groups:angⅱgroup (0.1μmol/ l)，5-aza group(10μmol/l)，angⅱ combined with 5-aza group (0.1μmol/l and 10μmol/l)，untreated group as control. after 24h induction, the medium was changed to complete culture medium without any inductor and the cells were culture for 4 weeks. the morphological changes were observed under phase contrast microscope. the effect of angⅱ and 5-aza on the bmmscs proliferation was observed with methyl thiazolyl tetrazolium (mtt) assay. the cardiomyogenic cells were identified by immunofluorescence staining. the differentiation ratio was examined by flow cytometer. the ultrastructures of the induced cells were viewed with a transmission electron s bmmscs of primary culture formed cell colonies at 14 days. the passaged cells were larger than those of primary culture. after induction, the cells presented long spindle, aligned in parallel and formed “muscle island”- like structure. mtt assay showed that the cell proliferation in angⅱ and 5-aza group outweighed that of in angⅱgroup or 5-aza group. the expression of specific protein of cardiac troponin i (ctni) in induced bmmscs was positive. flow cytometer showed that the differentiation ratio in angⅱgroup，5-aza group and angⅱ combined with 5-aza group were respectively(25.3±2.2)%，(24.6±1.9)%，(30.0 ±1.7)%, demonstrating that the differentiation ratio in angⅱ combined with 5-aza group was higher than that of in angⅱ group or 5-aza group(p>0.05). transmission electron microscopy showed that the induced cells had myofilaments, z line-like sion angiotensinⅱ combined with 5-azacytidine can induce the differentiation of bmmscs into cardiomyocyte-like cells, and the differentiation ratio was higher than that of in 5-aza only.
[key words] angiotensin ⅱ;5-azacytidine;bone marrow mesenchymal stem cells;cardiomyocyte-like cells
缺血性心脏病在我国的发病率逐年升高，严重威胁着人类的生存及生活质量。近几年来,细胞移植技术发展迅速，借助此技术可以在坏死部位移植具有收缩功能的细胞，为治疗缺血性心脏病提供了新的方法，也成为治疗缺血性心脏病的研究热点课题。随着研究的深入，选用的靶细胞目前多集中于有多向分化能力的各种干细胞，其中研究的较多的是骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, bmmscs)[1],有研究显示bmmscs可以被化学物质 5-氮杂胞苷 (5-azacytidine, 5-aza)诱导为心肌样细胞[2，3]。也有研究显示，血管紧张素ⅱ在体外可能经细胞外信号调节激酶通路诱导人bmmscs向心肌样细胞分化[4]，提示血管紧张素ⅱ对bmmscs的分化发挥重要作用。于是我们设想：血管紧张素ⅱ联合5-氮杂胞苷共同诱导能否提高bmmscs向心肌细胞的分化率 ?与单纯血管紧张素ⅱ及单纯 5-aza的诱导作用相比又有何差别?本实验即通过联合诱导培养，观察血管紧张素ⅱ联合5-氮杂胞苷对 bmmscs向心肌细胞分化所起的作用,并与传统诱导分化剂 5-aza比较。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与实验动物 angⅱ ( sigma, usa)， 5-azacytidine ( sigma, usa)，l-dmem 培养基(hyclone, usa)，胎牛血清(杭州四季青), 胰蛋白酶(sigma, usa), ficoll 淋巴细胞分离液(1.077g/ml,tbd公司), mtt (sigma，usa),dmso (sigma，usa)，羊抗鼠ctni抗体(santa cruz)，fitc标记的抗羊igg (boster)，hoechst33258 (sigma, usa)。健康sd 大鼠,4周龄,质量80～100g，雄性,由第四军医大学动物实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 bmmscs的体外分离和培养 颈椎脱臼法处死大鼠，取其四肢长骨，75%酒精浸泡5min。无菌条件下分离出胫骨和股骨，剪除两端骨骺，用不含血清的dmem培养液冲洗骨髓腔，充分混匀。将细胞悬液缓慢加入含淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min, 离心20min。取中间云雾状有核细胞层, 加入l-dmem不完全培养液，充分混匀后，1500r/min, 离心10min，弃上清，加入完全培养液，充分混匀后，调整细胞密度为1×106/ml，接种于t-25塑料培养瓶, 37℃含体积分数为0.05的co2孵箱中饱和湿度培养。3天后首次换液， 除去不贴壁的悬浮细胞，以后每3天换液1次。待细胞长到80%融合时, 用2.5g/l胰蛋白酶进行消化,按1：2的比例进行传代。体外培养至第3代备用。
1.2.2 bmmscs的诱导分化 将传至第3代的bmmscs进行分组诱导，共分为4组：(1)angⅱ组(终浓度为0.1μmol/l);(2)5-aza组(终浓度为10μmol/l);(3)angⅱ加5-aza组(终浓度分别为0.1μmol/l、10μmol/l);(4)空白对照组， 仅用基本培养基诱导。各组诱导24h后更换完全培养基继续培养,每3天换液1次, 并观察细胞形态变化, 连续培养4周。
1.2.3 形态学鉴定 每日在倒置显微镜下观察诱导前、后细胞生长和形态变化。
1.2.4 mtt法检测细胞活性并描绘细胞增殖曲线 将第3代bmmsc以1×105/ml接种于4个96孔板中, 每块板选取24孔，分为4组，每组6孔，每孔加200μl细胞悬液。培养24h后吸弃孔内培养液，pbs洗涤2次，前3组分别加入含angⅱ、5-aza、angⅱ和5-aza的诱导培养液，第4组加入基本培养基作为对照组。诱导24h后各组更换完全培养基继续培养。于培养 1、3、5、7天后进行mtt 检测，每孔加入20μl mtt(5mg/ml)，孵育4h后终止培养。弃孔内上清液,每孔再加入150μldmso, 打匀振荡10min,使结晶物充分溶解。选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(a),并描绘细胞增殖曲线。
1.2.5 免疫荧光细胞化学检测 将诱导培养1、2、3、4 周的细胞进行爬片，4%的多聚甲醛固定，3%过氧化氢-甲醇室温孵育10min ，正常山羊血清封闭，加ctni抗体，4℃过夜，pbs冲洗，加fitc标记的二抗，37℃孵育40min，pbs 冲洗，hoechst33258室温孵育10min，pbs 冲洗，甘油封片，荧光显微镜观察并拍照。
1.2.6 流式细胞计数法 2.5g/l的胰蛋白酶消化收集诱导4周的细胞, pbs调整细胞悬液密度约1×106个细胞 /ml, 滴加羊抗鼠 ctni抗体,室温 1h,再滴加 fitc标记的抗羊 igg,室温避光 40min,40g/l多聚甲醛固定 20min。最后流式细胞仪测定 fitc阳性标记细胞占细胞总数百分比。
1.2.7 透射电镜 胰蛋白酶消化收集诱导 4周的细胞,离心后使细胞成团，将细胞团置于3%戊二醛4℃固定2h，3g/l锇酸固定20min,0.1mol/l pbs洗2～3次。梯度浓度丙酮脱水。环氧丙烷+包埋剂(1：1)包埋细胞团块，修块，超薄切片，铜网捞起。铅铀染色，电镜观察。
1.3 统计学处理 所有数据用spss 15.0统计软件进行处理，结果(x±s)表示，组间均数比较采用t检验，p≤0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 bmmscs分离培养及诱导分化 原代bmmscs 呈圆形, 折光性强(图1a)。3天后几乎均贴壁且绝大部分伸展, 形态多样, 以短梭形为主, 也有三角形、多角形、扇形或星形细胞, 伸出长短不一、粗细不等的胞质突起。5～7天后, 细胞生长加速, 逐步形成大小不一、分散的细胞集落, 呈放射状向四周扩展, 细胞呈漩涡状或平行排列。14天时, 细胞集落间融合成单层(图1b)。传代后细胞体积较原代细胞大，呈长梭形, 混杂少量的三角形或多角形细胞。angⅱ与5-aza作用后,细胞形态及排列开始出现变化，细胞体积明显增大，诱导3周后呈较均一的长梭形,排列方向趋于一致 (图 1c),并出现“肌岛”样结构(图 1d)。
2.2 细胞增殖能力检测结果 mtt法检测结果显示：各组细胞的增殖能力在第3天均有所抑制，之后随着时间的延长而逐渐增强(见图2)。angⅱ联合5-aza组细胞的增殖能力高于angⅱ组或5-aza组(p<0.05)，而angⅱ组和5-aza组的细胞增殖能力差异无显著性(p>0.05)。各组细胞的增殖能力均高于对照组(p<0.05)。图2 细胞增殖曲线
2.3 免疫荧光鉴定结果 angⅱ联合5-aza诱导的bmmscs第2周即开始微弱表达ctni，第3周强表达ctni, 可见细胞质内ctni 的表达呈绿色荧光 (见图3a) 。angⅱ诱导的bmmscs第3周开始表达ctni，5-aza诱导的bmmscs第4周才表达ctni。对照组bmmscs不表达ctni,免疫荧光染色为阴性(见图3b)。
2.4 流式细胞计数结果 流式细胞仪检测 angⅱ联合5-aza组 fitc阳性的心肌样细胞占细胞总数 (30.0±1.7)%, angⅱ组 fitc阳性的心肌样细胞占细胞总数 (25.3 ±2.2)%，5-aza组 fitc阳性的心肌样细胞占细胞总数 (24.6±1.9)%，对照组细胞分化率为0。结果显示：angⅱ联合 5-aza组心肌样细胞诱导率高于angⅱ组与5-氮胞苷组(p>0.05)。
2.5 透射电镜结果 诱导后的细胞内富含大量的线粒体和内质网，细胞器聚集在核周围，可见肌丝、z线样物质、缝隙连接,符合心肌细胞超微结构(见图4)。对照组bmmscs仅具有线粒体、内质网等正常细胞器结构，未见肌丝样结构、z线样物质形成。
3 讨论
骨髓间充质干细胞在体外经 5 -氮胞苷诱导后可分化为心肌样细胞这一研究成果使细胞移植治疗充血性心力衰竭成为可能。但是， 其诱导率很低，临床安全性和长期有效性还不清楚，故这一方法要真正应用于临床还有许多问题没有解决。因此，寻找安全、有效、诱导分化率高的药物成为迫切需要解决的问题。有研究显示，血管紧张素ⅱ在体外可诱导人bmmscs向心肌样细胞分化，但目前国内外尚没有用angⅱ联合 5-aza共同诱导bmmsc体外诱导分化为心肌细胞的研究。
angⅱ是一种肽类激素，作为一种细胞因子具有调节水钠代谢、血管张力的生理作用，同时 angⅱ又是一种生长因子，刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞的增殖。研究表明：angⅱ是血管平滑肌细胞强大的丝裂原，它可通过自分泌、旁分泌刺激血管平滑肌细胞的 dna和蛋白质合成增加，导致细胞数目增多[5]。还可促进血小板衍生生长因子(pdgf)、碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf)的合成和释放，使angⅱ促血管平滑肌细胞分裂、增殖作用加强[6，7]。因此，本实验选择 angⅱ联合5-aza作为诱导剂，期望能够促进bmmscs向心肌样细胞的分化。mtt结果示，angⅱ联合5-aza组增殖能力最强，这说明angⅱ能够促进bmmscs向心肌样细胞的增殖分化。
本研究通过免疫荧光检测发现bmmscs诱导后与未诱导的 bmmscs完全不同, 诱导组ctni均有表达, 而未诱导组的 bmmscs则不表达。tn是横纹肌结构蛋白，是肌肉组织收缩的调节蛋白，位于细肌丝上。它的主要功能是通过与ca2+结合来控制细肌丝与粗肌丝之间的滑行，从而调节肌肉收缩。tn呈球形，有3个亚单位构成，即 tni、tnc、tnt。 心肌肌钙蛋白i(ctni)仅存在于心房肌和心室肌中,是鉴定心肌细胞的特异性蛋白。所以，本研究检测诱导后ctni的表达，以验证bmmsc向心肌细胞的分化。ctni的阳性结果表明转化的心肌细胞包含了心肌特异性的基因和蛋白。
大量的研究表明, 5-aza诱导 bmmscs分化为心肌样细胞的机制可能是 5-aza引起细胞 dna中的胞嘧啶去甲基化, 从而激活肌细胞特异的基因表达[8]。但angⅱ的诱导分化机制尚不十分清楚，有研究显示，angⅱ与其受体结合，能活化多条信号通路，导致多种细胞活化[9]。payne等[10]研究证实， angⅱ可通过引起mapk发生酪氨酸磷酸化而活化 erk。erk是哺乳类动物和无脊柱动物细胞中最早发现的丝裂素激活蛋白激酶家族的核心成员，是目前研究比较清楚的刺激转录增加的一条通路。该通路最主要的激活信号来自生长因子，通过改变靶蛋白的磷酸化在细胞生长、迁移及分化等信号传递中起重要作用。多种细胞因子包括 ang ⅱ通过其受体可激活 erk，导致几个早期即刻基因 c-fos、c-jun、erl-1 等表达增加[11]。另有研究显示，血管紧张素ⅱ能促进细胞 tgf-β1基因、tgf-β受体基因表达[12]， 同时 tgf-β又可激活包括mapk, pka和 pkc等在内的细胞信号通路[13]。angⅱ还可以激活plc，水解磷脂酰肌醇 4，5-二磷酸(pip2)生成肌醇 1，4，5-三磷酸 (inositol trisphosphate， ip3 ) 和二酰甘油 (diacyl glycerol， dg)[14]。ip3 和dg作为第二信使分别激动2个信号传递途径即ip3/ca2+和dg/pkc通路，ip3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部ca2+释放，引起细胞内ca2+平增加，从而启动细胞内ca2+信号系统，即通过依赖ca2+、钙结合蛋白的酶类活性变化来调节生理过程[15]。因此，angⅱ联合5-aza在诱导 bmmscs转变为心肌样细胞中的作用可能与angⅱ能活化多条信号通路、分泌某些诱导因子及5-aza引起细胞 dna中的胞嘧啶去甲基化作用有关， 但确切机制尚有待于进一步研究与探讨。
本研究初步探讨了angⅱ联合 5-aza共同诱导bmmsc分化为心肌样细胞的作用， 发现无论从分化细胞的形态、免疫组织化学， 还是细胞超微结构方面, 都表明bmmscs在angⅱ联合 5-aza作用下可向心肌样细胞转化， 具有心肌细胞的特性，且诱导分化率高于传统5-aza诱导。这为推动应用bmmscs治疗心肌梗死或心肌损伤， 为细胞移植治疗有关心血管疾病提供了一种新思路。
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