小鼠心肌缺血再灌注损伤模型(药物对大鼠急性心肌缺血的对抗作用)

【摘要】 目的：研究缺血后处理对大鼠缺血/再灌注心肌髓过氧化物酶（mpo）及可溶性细胞间粘附分子（sicam）的影响。方法：选择健康sd大鼠48只，随机分为3组：假手术组、缺血再灌注组（对照组）和缺血后处理组，每组16只。制备大鼠心肌缺血再灌注模型。缺血再灌注组,收紧结扎线缺血40 min, 放松结扎线再灌注240 min；缺血后处理组,缺血40 min后, 再灌注10 s,缺血10 s,连续3个循环，然后再灌注240 min；假手术组，开胸后穿线做套环，但不收紧结扎线。再灌注结束后检测血清肌酸激酶（ck）活性、sicam含量及心肌mpo活性。结果：①血清ck活性：试验后缺血后处理组和缺血再灌注组（对照组）的ck活性明显高于假手术组[分别为（736.28±21.72），（987.62±28.58），（256.34±19.34）u/l，p<0.01], 缺血后处理组的明显低于对照组(p<0.01)。②心肌mpo活性：缺血后处理组和对照组的均显著高于假手术组（p<0.01），缺血后处理组的较对照组显著降低［（0.86±0.08）u/g∶（1.28±0.26）u/g，p<0.01］。③血清sicam含量：缺血后处理组和对照组血清的sicam含量均显著高于假手术组（p<0.01）。缺血后处理组的较对照组显著降低［（54.28±11.69）ng/ml∶（76.62±13.45）ng/ml，p<0.01］。结论：缺血后处理可减轻缺血再灌注损伤，其机制可能与减轻氧化损伤、抑制白细胞的粘附有关。

【关键词】 心肌再灌注损伤；细胞粘附分子；过氧化物酶

　effect of postconditioning on mpo and sicam in rats with myocardial ischemia reperfusion/liu shenghui, huo yue, yin boying//chinese journal of cardiovascular rehabilitation medicine,2009,18(2):107

abstract：objective:to study the effect of postconditioning on mpo and sicam in rats with myocardial ischemia s: totally 48 rats were randomly divided into three groups: control group (n =16):in anesthetized openchest rats, the left anterior descending (lad) coronary artery was occluded for 40 min and reperfused for 4 h,no intervention for reperfusion; ischemic postconditioning (ip) group (n = 16): after lad occlusion 40 min, three cycles of 10 s reperfusion followed by 10 s lad reocclusion were applied during the first minute of reperfusion,then reperfused for 4 h; sham group (n=16):the surgical procedure was identical to other groups, but the lad ligature was not ligated. the serum creatine kinase(ck),myeloperoxidase (mpo) activity and sicam content were s:serum ck activity in ip group was lower than that in control group［（736.28±21.72）u/l,（987.62±28.58）u/l，p<0.01］. both the mpo activity and sicam content were lower in ip group than those in control group［（0.86±0.08）u/g∶（1.28±0.26）u/g，（54.28±11.69）ng/ml∶（76.62±13.45）ng/ml respectively,p<0.01］.conclusion:ip has protective effect on injury induced by i/r in rats. it has the effect decreasing mpo activity and ameliorating neutrophil adhesion and infiltration.

author′s　address：department of cardiology,affiliated hospital of hebei university,baoding,hebei,071000,china

key words：myocardial reperfusion injury;cell adhesion molecule;peroxidase

缺血后处理是指心肌发生缺血后，开始再灌注前进行数次短暂再灌注/缺血的循环，它是近年提出的一种新的减轻再灌注损伤的方法。研究表明缺血后处理可以缩小心肌梗死面积，减少再灌注心律失常，具有心肌保护作用[1～3]。粘附分子是介导中性粒细胞与血管内皮细胞粘附的分子基础，髓过氧化物酶（mpo）的活性可以反应心肌组织中中性粒细胞的浸润程度。本研究旨在探讨在体情况下观察缺血后处理对大鼠缺血再灌注心肌mpo及可溶性细胞间粘附分子（sicam）的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级sd大鼠48只，雄性，体质量(250±30)g,由北京大学医学部实验动物中心提供。

1.2 动物模型制备及分组

1.2.1 动物模型制备：实验大鼠以30 g/l戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉, 仰卧固定于鼠台，行气管切开,用呼吸机进行机械通气,通气频率60次/min, 潮气量20～30 ml/kg，取左胸第3肋间进胸，暴露心脏,于左心耳根部下方1 mm处进针, 5～0 丝线(结扎线) 穿过心肌表层在肺动脉圆锥处稍下方穿线，线两端各穿一小缝合垫片后再并线一起经内径约2 mm的聚乙烯管中穿出，用血管钳推压小管压迫左冠状动脉前降支造成缺血，放松即可恢复血流形成再灌注，收紧结扎线心电图出现st段抬高, 放松结扎线st段下降1/2 以上为模型成功。

1.2.2 动物分组：随机分为3组：①假手术组，开胸后穿线做套环，但不收紧结扎线；②缺血再灌注组（对照组）,收紧结扎线缺血40 min, 放松结扎线再灌注240 min；③缺血后处理组(ip组）,缺血40 min后, 再灌注10 s,缺血10 s,连续3个循环，然后再灌注240 min。

1.3 检测指标

1.3.1 肌酸激酶（ck）、sicam的检测：再灌注结束后自右颈动脉分别采血2 ml, 3 000 r/ min离心10 min, -70 ℃冰箱保存待测。采用7180型全自动生化分析仪（日本日立公司）检测ck 的含量，参照试剂盒（北京中山生物技术有限公司）说明书操作；采用双抗体夹心elisa法测定sicam，参照试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）说明书操作。

1.3.2 心肌mpo活性检测：实验完毕后取缺血区心肌制备成组织匀浆， 4℃离心30min,取上清液-70℃冰箱保存，按mpo试剂盒(购于南京建成生物公司)说明操作,在460 nm处测对照管和实验管的光密度值[d ( 460 )]，计算mpo 活力。mpo活性以37℃的反应体系中h2o2被分解1μmol为1个酶活力单位。

1.4 统计学分析

采用spss 11.5统计软件进行数据处理，计量数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，p< 0.05为差异有显著性。

2 结 果

再灌注结束后缺血后处理组和缺血再灌注组ck 、sicam及心肌mpo活性明显高于假手术组, 缺血后处理组明显低于缺血再灌注组(p均<0.05)，见表1。表1 各组肌酸激酶（ck）、可溶性细胞间粘附分子（sicam）及心肌髓过氧化物酶（mpo）活性检测结果（16例）注：与假手术组比较△△p<0.01；与缺血再灌注组比较▲▲p<0.01。

3 讨 论

缺血后处理对再灌注心肌的保护作用是2003年赵志清教授首先发现的 [1]，staat等[3]2005年率先在临床上证实了其心肌保护作用。缺血后处理的保护机制可能与氧自由基的生成减少、内源性活性物质的释放、膜通道功能状态的变化和蛋白激酶的活化有关[1，4～6]。我们先前的研究[7，8]表明缺血后处理具有抑制凋亡、减轻ami患者再灌注损伤的作用。

中性粒细胞在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用。大量活化的中性粒细胞聚集在心肌微血管内并侵润到心肌组织中,通过释放炎性物质、氧自由基、蛋白酶等引起心肌损伤[9]。细胞粘附分子介导了中性粒细胞对组织细胞的粘附浸润，icam - 1的细胞外部分能被特异性蛋白酶催化裂解，脱落至血液循环中形成可溶性细胞粘附分子，sicam可间接反映icam - 1的表达情况。本研究发现缺血后处理组sicam活性明显降低，提示缺血后处理抑制细胞粘附分子的表达，减少中性粒细胞对组织细胞的粘附，从而减轻再灌注损伤。

mpo 是中性粒细胞的特异性酶，能催化产生多种活性氧化物质，导致氧化应激和氧化性组织损伤，其激活程度与中性粒细胞的浸润程度密切相关，其活性的测定可以反映中性粒细胞浸润情况，本研究发现缺血后处理组心肌组织mpo水平明显减低，提示缺血后处理减少了中性粒细胞的浸润。

缺血后处理可以减轻再灌注损伤，其机制可能与抑制细胞粘附分子的表达，减少中性粒细胞对组织细胞的粘附浸润有关。

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