肝细胞肝癌的诱发因素(影响肝的生物转化的因素有)

【摘要】 目的 探讨结缔组织生长因子（ctgf/ccn2）对肝癌细胞生物学行为的调控作用，及其与pparγ在肝癌中的相互关系。方法 免疫组织化学法检测hepg2细胞中ctgf及pparγ蛋白的表达。经不同浓度、不同时间的ctgf抗体封闭处理人肝癌细胞hepg2后,mtt法测定细胞活力,博依登小室测定细胞侵袭及迁移特性的改变。经pparγ激动剂(rosiglitazone,罗格列酮)处理hepg2细胞后， rtpcr 检测ctgf mrna表达的改变。结果 hepg2细胞表达ctgf及pparγ蛋白。肝癌细胞经ctgf抗体处理后，其增殖受抑制,且呈时间和剂量依赖性,同时细胞的侵袭、迁移能力也受到抑制。hepg2 细胞经罗格列酮处理后，其ctgf mrna的表达下降。结论 ctgf可以调控肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。pparγ调控肝癌细胞的生长，部分是通过改变ctgf的表达来实现的。

【关键词】 ctgf; pparγ; 侵袭; 迁移; 人肝癌细胞

influence of ctgf on hepatocellular carcinoma cells and correlation with pparγ

cai wei, zhang fang, liu wei, yang aijun, wang chenyu, li min

institute of pathology, lanzhou university, lanzhou 730000, china

corresponding author: li min, email: limin0606@tract：objective to investigate the effect of connective tissue growth factor (ctgf/ccn2) on the growth of human hepatocellular carcinoma cells, and explore the correlation between pparγ and ctgf. methods the expression of ctgf and pparγ protein in hepg2 cell was detected by 2 cells treated with the antibody of ctgf, at different concentrations for different periods. the proliferation of hepg2 cells was assessed by mtt. the change of invasion and immigration of hepg2 cells were detected by boyden. the mrna level of ctgf in hepg2 cells treated with rosiglitazone was detected by rtpcr. results hepg2 cells express ctgf and pparγ protein. mtt assay demonstrated that antibody of ctgf had inhibitory effect on the proliferation of hepg2 cells in a timeand dosedependent invasion and immigration of hepg2 cells were inhibited,too. the result of rtpcr demonstrated that the mrna level of ctgf was downregulated after treated with rosiglitazone. conclusion the antibody of ctgf could inhibit the proliferation, invasion and immigration of hepg2 cells. the mechanism of pparγ regulating the growth of hcc cell may be associated with downregulating the expression of ctgf.

key words：ctgf; pparγ; invasion; immigration; hepatocellular carcinoma cells

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, ctgf/ccn2)是一种即刻早期反应基因,它属于ccn家族，与肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管的发生等相关[1]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptors,pparγ)是一类核转录因子[2],同样具有调控肿瘤细胞分化,抑制增殖的作用。本实验观察了ctgf对肝癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响，以及与pparγ两者之间的相互关系。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人肝癌细胞株hepg2由兰州大学病理学研究所提供。四甲基唑蓝（美国sigma公司）。兔抗人多克隆ctgf抗体及pparγ抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。鼠抗人单克隆ctgf抗体（美国santa cruz公司）。sp免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。鼠尾胶（本实验室自制）。pparγ激动剂罗格列酮（rgz）（浙江万马公司），完全溶于二甲基亚砜，dmso终浓度不超过0.1%。博依登小室（美国millipore公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 免疫组织化学法检测hepg2细胞中ctgf及pparγ蛋白的表达 取对数生长期的hepg2细胞，制成单细胞悬液后爬片。免疫组织化学染色按试剂盒说明操作。制片后光镜下观察细胞，细胞浆或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性染色。

1.2.2 ctgf对人肝癌细胞hepg2增殖能力的影响 取对数生长期的hepg2细胞制成单细胞悬液,调整细胞密度为3×104／ml,悬浮于含10% fbs的rpmi1640培养液中，接种于96孔板,每孔200μl。待细胞贴壁后,吸去原培养基,加入含浓度分别为5、10、20、 50μg/ml ctgf抗体的新鲜rpmi1640培养液（含10%fbs）, 每个浓度设4个复孔,同时设立对照组(无fbs的rpmi 1640组作为mtt值的调零组，仅加入细胞未经抗体封闭组作为抑制率计算时的对照组a值)。在分别培养24、48、72h后,每孔加入mtt（5μg/ml）液 20μl, 继续孵育4h, 终止培养。小心吸弃培养上清液, 每孔加入二甲基亚砜150μl, 振荡10min, 酶标仪测570nm波长a值。重复3次试验, 取均值。按以下公式计算，抑制率(inhibition rate, ir)%=(1-实验组a 值/对照组a值) ×100%。

1.2.3 ctgf对人肝癌细胞hepg2侵袭能力的影响 博依登小室下室加入含40％ fbs的新鲜rpmi 1640培养液，终体积为200μl。将浓度为3g/l的自制鼠尾胶按每孔40μl均匀地铺在博依登小室上下室之间的孔径为8μm的滤膜的上室面上，置37℃ 30min聚合成凝胶。上室加入细胞密度为1.0×106/ml的hepg2单细胞悬液（细胞预先在不含fbs的rpmi 1640培养液中培养24h），上室终体积为300μl，将小室置于6孔板内，培养48h后用棉签擦掉鼠尾胶, pbs洗3次，95%乙醇固定，苏木素染色，相差显微镜观察、拍照并计数。每个滤膜分别计数随机5个视野内的穿膜细胞数后计算平均值。每组设3个平行小室,重复实验3次。

试验分为两组，a组：上室细胞不加处理组；b组：上室细胞预先用ctgf抗体封闭处理48h，抗体浓度为10μg/ml。

1.2.4 ctgf对人肝癌细胞hepg2迁移能力的影响 膜的上室面不铺鼠尾胶；上室细胞浓度为6.0×105/ml，其余同方法1.2.3。

1.2.5 rtpcr检测pparγ激动剂处理前、后ctgf的表达 marker由大连宝生物提供，序列号为d513a。rtpcr引物设计参照有关文献,经基因库核实,由上海生物工程公司合成。设计引物序列如下: ctgf的上游引物5′gcaggctagagaagcag

agc3′,下游引物5′atgtcttcatgctggtgcag3′, 产物大小为105bp；内参βactin的上游引物5′tggagaagagctatgagctgcctg3′，下游引物5′gtgccaccagacagcactgtgttg3′产物大小为202bp。细胞预先经pparγ激动剂处理（参照以往实验结果，激动剂浓度选择40μmol/l，处理48h），按trizol试剂盒说明书提取细胞中的总rna，反应条件为50℃逆转录30min, 94℃预变性5min，94℃变性30s,54℃退火1min,72℃延伸1min,进行35个循环，最后72℃延伸7min，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中拍照记录、分析结果。

1.3 统计学方法

采用spss 10.0软件, 所有指标采用±s表示, 组间比较采用一个样本的anova统计学方法处理，检验水准α=0.05，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学法检测人肝癌细胞hepg2中ctgf及pparγ蛋白的表达

结果显示，hepg2细胞中有ctgf及pparγ蛋白的表达，ctgf蛋白主要表达于细胞浆，见图1，pparγ蛋白主要表达于细胞核，细胞浆有部分表达，见图2。

2.2 ctgf对人肝癌细胞hepg2增殖能力的影响

经ctgf抗体封闭处理后， hepg2细胞的增殖受到明显抑制,且抗体浓度越大，抑制越明显,同一抗体浓度时，48h抑制率达到最大值。10～50μg/ml的ctgf抗体处理后，hepg2细胞的生长抑制与对照组相比，差异有统计学意义（p<0.01），而5μg/ml组与对照组相比，差异无统计学意义（p>0.05），见图3。

2.3 ctgf对人肝癌细胞hepg2侵袭及迁移能力的影响

侵袭实验结果显示:与ctgf抗体处理前（图4a, 蓝染的为苏木素染色的细胞核）相比，处理后（图4b）穿膜细胞数目减少, 差异有统计学意义(p<0.05)，见表1。迁移实验结果显示：与处理前相比， ctgf抗体封闭处理之后，穿膜迁移的细胞数目也有所减少, 变化趋势基本与侵袭实验一致, 差异亦有统计学意义(p<0.05)，见表1。

2.4 rtpcr检测pparγ激动剂处理前、后ctgf的表达表1 ctgf抗体处理前后侵袭及迁移细胞结果显示，hepg2细胞中有ctgf mrna的表达，pparγ激动剂处理后,ctgf mrna的表达降低，见图5。

3 讨论

目前所发现的ccn家族包括cry61、 ctgf、 nov、wisp1、wisp2和wisp3六个成员。1991年由bradham等[3]首先在人类脐静脉内皮细胞条件培养基中发现了人类的ctgf(hctgf)。对于ctgf的研究，以往主要集中在器官纤维化中，有研究显示[45]，在肾脏、肝脏等组织的纤维化过程中，ctgf可以通过多种途径调控组织纤维化的发生、发展过程。

ccn是一组功能复杂的基因, 随着近年来研究的逐步深入，ctgf对肿瘤的生长、侵袭、转移方面的影响越来越受到人们的关注。研究发现,胰腺癌、软骨肉瘤中ctgf的表达升高[6],在约61%的急性淋巴细胞白血病患者的骨髓中也出现ctgf的过度表达[7]。

我们的研究发现，ctgf的抗体封闭处理后，hepg2细胞的增殖明显受到抑制，呈剂量依赖关系，从时间上来讲，48h抑制率达到最大值。进一步在侵袭及迁移实验中发现，抗体封闭处理后，两项实验中穿膜的细胞数目相对于未处理组都有所减少。我们的结果证实了，ctgf对肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力都有所影响，提示在肝癌发生、发展过程中,ctgf可能发挥重要的调控作用。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptors,ppar) 是核激素受体超家族的成员,该受体有3 种亚型:pparα、pparγ和pparβδ，这3 种亚型在结构及功能上均有所差异。pparγ与配体结合后被激活，其配体包括天然配体和合成配体两类, 罗格列酮就是pparγ的合成配体之一。

研究表明，pparγ活化后抗肿瘤机制主要是通过调节细胞周期[8]、诱导凋亡[9]、抑制cox2的表达[10]等途径来实现。

基于pparγctgf途径的考虑,rtpcr检测经罗格列酮预先处理组及未处理组ctgf表达的改变发现，处理组ctgf的表达相对于未处理组下降，提示pparγ参与调控肝癌细胞hepg2的生长，部分是通过改变ctgf的表达来实现的。这就提示我们，在肝脏组织中，不仅在纤维化过程中pparγctgf途径发挥重要的作用，在肝癌的发生发展过程中，pparγctgf通路是同样存在并且发挥调控作用的。

我们的结果证实了ctgf对肝癌细胞的生物学行为发挥了重要的影响作用，而发现肝癌中pparγctgf途径无疑为我们的研究和临床治疗提供了一个新的方向。

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