子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，以来源于内膜腺体的腺癌最常见。为女性生殖道三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%。近年来发病率在世界范围内呈上升趋势。早期患者预后较好，而晚期患者多有盆腔外转移，预后差，虽然采用手术、放射、药物等综合治疗，但5年生存率仍较低，因此寻找新的治疗方法迫在眉睫 [1]。溶瘤病毒治疗是近年来兴起的一种新的肿瘤治疗途径，其机制在于利用基因工程对病毒进行改造，使其在肿瘤中选择性复制并产生溶瘤作用[2]。病毒溶瘤结合其他治疗，使得肿瘤治疗的疗效显著提高，得到我国政府的重视，不断加大投入，相继启动了一些与溶瘤病毒学密切相关的重大研究项目。麻疹病毒（MV）感染可诱导多种细胞凋亡，利用MV这一感染特性，有研究人员开展了利用MV治疗淋巴瘤、脑肿瘤、卵巢癌等的研究，并获得了较好的疗效[3-7]。尤其是利用基因重组的MV-CEA、MV-NIS（MV与放射性碘化钠的重组体）治疗卵巢癌的方法已用于一期临床试验[6-7]。JEC是一株人子宫内膜腺癌细胞系，研究证实子宫内膜腺癌细胞表面表达麻疹病毒结合受体CD46[8]。因此设想麻疹病毒是否对子宫内膜腺癌有抑制作用；其抑制作用是否通过诱导细胞凋亡实现？因此，本实验通过不同浓度的MV感染JEC细胞，然后观察不同感染浓度及时间细胞的增值及凋亡情况，并对病毒感染前后细胞Fas、FasL、TGF-β的表达进行测定，初步探讨MV对JEC的抑制作用及其相关机理，为利用MV对子宫内膜癌进行溶瘤治疗的进一步研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 麻疹病毒疫苗京160（北京天坛生物制品股份有限公司）；JEC细胞（遵义医学院微生物教研室）；Annexin-v FITC/PI试剂盒（晶美生物工程公司）；兔抗Fas、兔抗FasL、兔抗TGF-β（Santa Cruz公司）；小量凋亡DNA抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 病毒感染浓度的选定 TCID50测定按照中国生物制品规程操作，对病毒进行倍比稀释，接种JEC细胞，每个稀释度设4复孔，并设空白对照，置37 ℃、相对湿度97%、5% CO2孵箱中连续培养，观察7 d，以第7天感染细胞出现2孔或2孔以上多核巨细胞病变的病毒的最高稀释度作为病毒效价。
1.2.2 MTT检测 用96孔板接种细胞，待细胞贴壁伸展生长后，MV感染细胞，每个稀释度设6复孔，并设正常对照。感染后第1～10天分别进行MTT检测。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 按DNA提取试剂盒说明书提取经病毒感染12 d（根据预实验结果）的JEC细胞DNA，进行2%琼脂糖凝胶电泳，条件为60 V，4 h，然后使用凝胶成像分析系统检测电泳结果并拍照。
1.2.4 流式细胞术 于病毒感染后一定时间收集细胞，按Annexin-V FITC/PI试剂盒说明书进行操作，制备样品，上机检测细胞凋亡率。
1.2.5 免疫细胞化学法检测细胞凋亡机理 收集MV感染后12 d的细胞，进行石蜡包埋、切片，进行切片的免疫组化实验，观察细胞Fas、FasL以及TGF-β的表达变化，进行吸光度值的比较。设阴性对照、正常对照、病毒组。
1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0软件对所得数据进行统计分析，两变量的相关性以相关系数（r）值确定，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病毒TCID50 病毒TCID50的稀释度为1：160，本研究拟采用1：80、1：40、1：20、1：10四个稀释度作为感染浓度。
2.2 MTT检测 抑制率=1-（病毒组OD/正常对照组OD），见表1。每个稀释度设6复孔，同一感染浓度条件下，病毒感染时间与抑制率呈正相关（P<0.01）。感染后6 d内，病毒对细胞的生长表现为促进作用；而6 d后，开始出现抑制作用，同一感染浓度，各浓度组不同感染天数的组间均存在着差异（P<0.05或P<0.01），9、10 d抑制率与感染浓度呈正相关
2.3 凋亡特征性 DNA “Ladder”条带的形成在1：10、1：20、1：40稀释度出现了凋亡特征性的“Ladder”条带，而对照组无明显的DNA“Ladder”条带的出现，见图1。
图1 MV感染后JEC细胞DNA电泳结果
注：M：marker；1：阴性对照；2～4：1：10、1：20、1：40稀释度感染12 d
2.4 流式细胞仪检测JEC凋亡率的结果 每个稀释度设3复瓶培养，同一感染浓度条件下，随感染时间的延长，细胞凋亡率逐渐上升，两者为正相关。同一时间点与对照组比较，病毒组的细胞凋亡率升高（P<0.05或P<0.01），感染后12 d，感染浓度与凋亡率呈正相关，见表2。
2.5 免疫细胞化学法检测JEC细胞Fas、FasL以及TGF-β表达结果
2.5.1 Fas的表达 镜下Fas阳性染色主要位于细胞浆中，每组取8个不同视野进行光密度值测定，与正常对照组相比，病毒组Fas阳性反应强度增加，染色变深；正常对照组与阴性对照组相比，染色变深。经图像分析系统软件分析各组的平均吸光度值，结果显示与阴性对照组相比，正常对照、病毒组的平均光密度值降低。各组间比较差异显著（P<0.01），见表3。
2.5.2 FasL的表达 每组取8个不同视野进行光密度值测定，镜下观察FasL在阴性对照组、正常对照组、病毒感染组中均无表达。比较各组平均光密度值，各组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5.3 TGF-β的表达 每组取8个不同视野进行光密度值测定，镜下阴性对照组、正常对照组均不表达，病毒组阳性染色主要位于细胞浆内，经图像分析系统软件分析各组的平均光密度值。结果显示：与阴性对照组比较，正常对照组光密度值降低不明显，组间差异无统计学意义（P>0.05）；病毒组与上述两组相比平均光密度降低，组间比较差异有显著统计学意义（P<0.01）。
3 讨论
MV为单股负链RNA病毒，H、F和N（核蛋白）三种蛋白是麻疹病毒的主要抗原成分，MV通过CD46、SLAM（淋巴活化信号分子）、DC-SIGN（C-血凝素细胞间粘附分子）受体介导病毒的感染及传播，CD46是麻疹疫苗株和麻疹病毒实验室株的主要细胞受体[9-12]。SLAM在有活性的T 和B细胞表面上表达，是新发现的麻疹病毒细胞受体[13]。麻疹野生病毒、实验室株和麻疹疫苗株都能在有表达SLAM的细胞上产生典型的病变，诱导细胞凋亡，因此MV在人类肿瘤的溶瘤治疗中具有广泛的应用前景，其抗瘤谱包括多种淋巴、非淋巴人类恶性肿瘤。在妇科肿瘤中，国外已经将基因改造的MV应用于卵巢癌的I期临床试验[6-7]。国内亦有研究证实麻疹减毒活疫苗体外可抑制原代卵巢癌细胞生长，引起细胞病变和细胞凋亡，另有研究显示MV减毒株在组织培养中和裸鼠体内对HeLa人宫颈癌肿瘤有明显的杀伤作用，因此减毒MV疫苗株在妇科肿瘤中有很好的应用前景[14-15]。本研究将减毒麻疹疫苗感染人子宫内膜腺癌细胞，感染后6 d，亦表现为抑制细胞的生长，并诱导细胞凋亡，且细胞凋亡率与病毒的感染时间及感染浓度有关，由此，笔者推测MV抑制细胞生长可能是通过诱导细胞凋亡实现的。但是，在病毒感染6 d内，病毒对细胞的生长表现为促进作用，病毒浓度越高，其促进作用越强。推测其可能的原因是细胞感染早期，无细胞膜及线粒体膜的破裂，细胞相互融合，使线粒体的功能加强，还原MTT形成蓝紫色的甲臢结晶增多，导致OD值升高；也可能是MV感染初期细胞分泌促生长物质，使细胞生长加快。但这种推测，还有待进一步实验证明。总之，MV最终抑制JEC的生长，并诱导感染细胞的凋亡，可进一步用于人子宫内膜腺癌治疗的实验研究。
通过MV感染DC细胞的研究证明，人类DC细胞的凋亡是通过Fas/FasL介导[16]。另外，MV可通过诱导体外培养的外周血单核细胞（PBMC）Fas的表达，间接引起未感染MV但表达FasL的旁观者T细胞凋亡[17]。TGF-β既能增强某些细胞的增殖、分化能力，又能诱导某些细胞的凋亡反应，如TGF-β可诱导淋巴细胞、肝细胞、肝癌细胞、子宫上皮细胞凋亡及猴免疫缺陷病毒感染所致的B细胞淋巴瘤细胞的凋亡[18]。病毒感染可使TGF-β的表达增加，活性增强，促进凋亡的发生。实验结果显示，MV感染后12 d，各组细胞的凋亡率增至最高，并出现DNA Ladder凋亡条带，此时病毒组Fas、TGF-β的表达均增加，而FasL在正常对照及病毒感染组始终未表达。提示MV诱导JEC凋亡的机制可能与Fas及TGF-β的表达有一定的关系，但FasL不表达的原因仍有待今后进一步探讨。
参考文献
[1]万小平，蔡斌，刘玲，等.不同期别子宫内膜癌组织中差异表达基因的层次聚类分析[J].中华妇产科杂志，2006，41（1）：38-42.
.Mol Ther，2008，17（1）：57-64.
.Virology，2004，323（2）：292-302.
[4] Laine D，Bourhis J M，Longhi S，et s virus nucleoprotein induces cell- proliferation arrest and apoptosis through NTAIL-NR and NCORE-FcyRIIB1 interactions，respectively[J].J Gen Virol，2005，86（6）：1771-1784.
[5] Nakamura T，Russell S tic measles viruses for cancer therapy[J].Expert Opin Bio，2004，4（10）：1685-1692.
.Clin Cancer Res，2006，12（6）：1868-1875.
中国论文网(www.lunwen.net.cn)免费学术期刊论文发表,目录,论文查重入口,本科毕业论文怎么写,职称论文范文,论文摘要,论文文献资料,毕业论文格式,论文检测降重服务。
