酶工程在制药方面的应用(酶工程在医药方面的应用)

第1篇：酶工程技术在医药制药领域的应用

一、酶工程技术研究进展

1固定化酶酶工程的最初10年，主要兴趣在发展固定化方法和载体，探索其应用的可能性。第一代固定化生物催化剂的特征是单酶的固定化，发展了吸附、共价、交联和包埋等数十种固定化方法。现已有20多种利用单酶活力的固定化生物催化剂在世界上获得工业应用。

2多酶系统的固定化固定化单酶不可能引起发酵工业的根本变革。大多数生物化学产品的合成和转化必须依赖一连串酶反应，而且需要辅助因子和ATP的参与。早在70年代初已尝试将催化顺序反应的几种酶共固定，发现物质转化的速度比溶液中酶混合物高。70年代后期，辅酶的保持和再生又特别受到重视。

ATP和NAD在大分子化后可保持在半透膜内，往返于催化合成的酶与再生它们的酶之间。已知的酶有50%以上需要辅因的存在参与酶促反应。ATP、FAD、NAD、PLP与PQQ的再生都可能通过固定化技术获得不同程度的解决，其中包括这些辅因的固定化与其他酶促反应相偶联或对辅因进行化学修饰及利用这些辅因的类似物与衍生物等。

实验发现应用固定化辅因及其衍生物对酶的活力具有良好作用，如thioNAD与A-PAD对马肝醇脱氢酶的活力比NAD更有效。

亚细胞成份都是天然地巧妙定位的多酶集合体，从理论上推测，固定化各种细胞器就可能有效地利用各种多酶系统。我们曾固定化了羊精囊微粒体、鼠肝微粒体、线粒体和细胞质，为了克服固定化细胞器不够稳定的缺点，KangFuGu等人《构建了一种含有固定化多酶系统和NAD的人工细胞，用于将氨或尿素转变成必需的氨基酸，取得了良好结果。

3固定化细胞从单酶-多酶-细胞器固定化的进一步延伸就是进行完整细胞的固定化，其中包括微生物细胞，动物细胞与植物细胞的固定化。利用固定化细胞可以进行单酶催化反应，多酶催化反应，还可以进行细胞的生长与增殖，从而制造各种复杂生化物质。我们应用固定化细胞技术生产L-苹果酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸及1，6-二磷酸果糖等均取得了良好效果[3]。固定化酵母细胞反应器连续生产乙醇为80年代热门课题，我国已有应用于生产酒精和啤酒的类似工艺。

细胞固定化方法以包埋法为主，也使用吸附法、交联法与共价法。80年代以来人们更多地注意固定化活细胞与增殖细胞。

真核细胞，尤其是高度分化的动植物细胞已是生物工程领域中可考虑的最后二类生物催化剂。过去10年，发展了植物细胞培养，紫草宁和人参皂甙的工业化生产得到成功。

最近报道，应用细胞培养技术“发酵”生产贵重抗癌药物紫杉醇也已取得进展。可是，植物细胞的脆弱，生长缓慢和培养基成本过高限制了更多的成功。固定化所能给予微生物细胞的新特性也正可弥补植物细胞的缺陷。

植物细胞固定化大多采用包埋法。处于静止生长期的植物细胞用琼脂、琼脂糖、海藻酸钙或角叉菜胶固定化，往往可获得较高活力的制剂。也可用聚氨酯、尼龙或聚丙烯酰胺在有细胞存在时聚合成胶。通常细胞以低密度包埋在颗粒中，再经培养形成高密度和组织化，创造一定梯度的微环境。

固定化植物细胞可由简单的碳源进行生物合成，也可由外加前体进行简单的生物转化。例如海藻酸钙包埋的常春花细胞不仅可从色胺和开环马钱子减合成西萝芙木碱，还能从蔗糖经多步酶反应合成西萝芙木碱和蛇根碱。反应器可批式运转180d，产物比游离细胞多3倍，而聚氨酯包埋的辣椒细胞合成的辣椒素比游离细胞多2?3个数量级，迄今已报道了固定化南洋金花、烟草、胡萝卜等10多种细胞的研究。

植物细胞在固定化后，最大优点在于极易通过培养基成分及O2含量来调节细胞的生长期和生产期。固定化颗粒内细胞组织化，可能积累更多的次生代谢物。当培养基中加入蛋白质合成的抑制剂或转录抑制剂，或改变盐类、生长调节剂及碳源、就可使细胞生长受抑制，促进次生代谢途径畅通。

植物的次生代谢物一般都储存在液胞中；固定化的又一好处即在于可用二甲基亚砜等有机溶剂、去垢剂、抗菌素等处理诱导释放产物，而不影响细胞的存活。这些细胞重新在生长培养基中生长，又可恢复生产能力。

目前，固定化植物细胞生产生物碱和色素等的应用研究尚处于初级阶段，尚无实用的报道。在我国进行中药有效成分的生产应用的研究应有更好前景。

动物细胞是表达动物蛋白的宿主，基因重组和细胞融合技术可能创造出更高效能的新细胞株。然而动物细胞形态大，又无细胞壁、成倍时间长，而细胞密度、产物浓度和生产率都远低于微生物。这样“难得”的细胞又十分脆弱，悬浮式培养并不理想。在已经建立的固定化方法中，只有最温和的吸附和包埋法才得到成功。

目前动物细胞微囊化方法用得最多的是聚赖氨酸/海藻酸（PLL/ALG)法，细胞包埋于海藻酸钙后，再用聚赖氨酸处理复盖半透膜后，则可使细胞在微囊内充分生长，细胞生长密度可达108～109。微囊化细胞主要有两方面应用：一是培养微囊化动物细胞生产一些药物，二是作为药物直接用于治疗或作为药物筛选之用。

有报道，微囊化杂交瘤细胞在40L反应器内运转2?3星期，可生产5?20g单克隆抗体，这相当于游离细胞在5000L培养罐中的能力。

固定化动物细胞主要用来生产单克隆抗体、干扰素、组织纤溶酶原激活剂（TPA)、白细胞介素、胰岛素生长因子和乙肝病毒表面抗原等。

可以预见，未来将有一大批具生物活性的蛋白质可依赖固定化细胞在生物体外大规模地合成。

4基因工程菌的固定化通常，有一种生化反应存在，就会有一种酶的催化作用促其进行。因此可以充分利用酶促反应来制造人们所需要的各种化学产品。但是生物细胞合成的酶量由于机体生命活动平衡调节的需要，一般不会表达出很高的浓度，这就限制了直接利用天然酶来解决更多化学反应的可能性，基因工程技术的进展和实用化为此开辟了有效途径。只要生物细胞中存在有催化某一生化反应的酶，即使其量微不足道，应用基因重组技术，通过基因扩增与增强表达，人们就可能建立高效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞。

从而进一步构建成新一代的催化剂——固定化工程菌或固定化工程细胞。如德国BM公司应用蛋白质工程技术，对表达青霉素酰化酶的基因进行点突变改造，重建了青霉素酰化酶工程菌，从而大大延长了固定化青霉素酰化酶的使用半衰期，其固定化酶柱可连续使用700天以上[5]。又如应用DNA重组技术建立了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌，这种工程菌组装的生物反应器可以用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸，每升反应液含丝氨酸超过400g，再从丝氨酸与吲哚转化生成色氨酸，反应液中色氨酸浓度达到200g/LW。

Taragi等将ificans的L-苯丙氨酸转氨酶基因克隆到12突变株DG30，然后构建JpPA142质粒（系将含转氨酶基因的模板插入到高表达、高拷贝载体PUC16上），具有JpPA1142质粒的工程菌株12，HB101与野生菌相比，其转氨酶活力高20?30倍，因此，是用于工业化生产L-phe的高效工程菌。作者所在实验室应用PCR法也成功地从中克隆了苯丙氨酸转氨酶基因，构建了生产苯丙第酸的转氨酶工程菌，并开展了固定化研究和应用[7]。

二、酶工程技术在医药领域的应用

据不完全统计，应用酶工程技术所产生的工业产值已达几百亿美元。已形成工业化规模的应用领域有：淀粉制糖工业、乳制品工业、其它食品与发酵工业、氨基酸工业。目前，固定化酶正日益成为工业应用方面的主力军，在化工医药、轻工食品、环境保护等领域将发挥巨大作用。尤其在有机酸如柠檬酸、L-苹果酸、L-乳酸；氨基酸如L>天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、L-色氨酸以及药物产品如1，6-二磷酸果糖、头孢霉素及工业酒精的生产方面都有可能应用酶工程技术进行规模化生产，从而极大程度地改变医药工业和发酵工业的生产方式。包括辅助因子再生系统在内的固定化多彳梅系统现正成为酶工程应用领域的主角。固定化基因工程菌、工程细胞以及固定化技术与连续生物反应器的巧妙结合，将导致整个发酵工业和化学合成工业的根本性变革。

1应用酶工程技术制备的产物

1.1应用酶工程技术制造初级代谢产物或中间代谢产物[8]应用固定化细胞可大量生产各种初级代谢产物或中间代谢产物如糖、有机酸、氨基酸等。典型的产品有D-葡萄糖、D-果糖、甘油、1，6-二磷酸果糖、柠檬酸、苹果酸、富马酸、乳酸、右旋糖酐、丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸等。现举两例说明：(1)应用包埋法或吸附法固定化（Sao，lMM3〇)发酵生产甘油。用海藻酸钙和卡拉胶包埋法生产甘油，产量分别为23.6g/L和27.4g/L，用聚丙烯酰肼（PAAH)包埋法，甘油产量为26.6?32g/而应用烧结玻璃吸附固定化，甘油浓度为26.2?29.5g/L，连续运转400h，多数细胞仍然结合在载体上。(2)应用海藻酸钙包埋固定化曲霉（八8-，1MM160ATCC11414)生产柠檬酸，连续运转12d以后，反应液中柠檬酸浓度达到14g/L，而且连续柱反应器比批式法取得更好的结果，因为反应产物中柠檬酸浓度的增加会抑制菌体对葡萄糖的利用。

1.2应用酶工程技术生产次级代谢产物通过新陈代谢产生的数量极少，作用大，具有明显的种属特征的代谢产物，称为次级代谢产物，如抗生素、色素、生物碱、性引诱剂、信息素(外激素)等。酶工程技术生产这些次级代谢产物已取得很大进展。典型的产品有64?八、7-八1)€八、7-八€八、麦角生物碱、羟化孕酮、可的松和肉毒碱等。

(1)应用酶工程技术生产新型抗生素W应用酶工程技术大规模生产和转化P?内酰胺类抗生素，进一步合成各种头孢霉素已在国内外大量推广。我国用固定化大环内酯-4-丙酯化酶将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素，用固定化生产米卡链霉菌突变株亦可完成转化(见表，1)。

(2)应用海藻酸耗包埋生产麦角碱。用2%、4%和8%海藻酸钙包埋菌丝体、然后在种子培养基中培养8d，每14天将培养基与固定化细胞分离，进行半连续发酵，经生理盐水洗涤后，添加新鲜培养基重新发酵培养。

菌株可产生裸麦角碱、田麦角碱、野麦角碱和麦角新碱。发现，随着海藻酸钙浓度的增加，各种生物碱的收率不同。用2%与4%海藻酸钙固定化时以野麦角碱为主要产物。而在8%海藻酸钙固定化时则以田麦角碱为主要产物。而且固定化细胞可以运转32周，其生物碱产量为游离细胞的25倍。

(3)应用酶工程技术转化甾体在甾体激素转化中，随着生物技术的发展，利用微生物酶工程技术不仅研究提高某一步转化反应的专一性和收率或寻找某一转化反应来代替某一个用化学合成法难于进行的反应，而且进一步综合应用了酶抑制剂，生化阻断突变株和细胞通透性的改变等生物技术从而制得了雄甾-1“二烯-3，17二酮，雄甾-4-烯-3-17二酮（4AD)和3氧联降胆留1，4二烯-20酸(BDA)等几个关键中间体，使复杂的天然资源经过几步反应就合成了各种性激素和皮质激素。应用酶工程技术进行留体转化已取得很好效果。

2酶工程技术在医药领域的应用

目前已知能利用微生物和酶进行的转化反应有50余种，因此酶工程技术已成为新药开发和改造传统制药工艺的重要手段。

2.1在制药工业上的应用(1)抗生素工业制造6-氨基青霉烷酸青霉素酰化酶），7-烷基头孢烷酸头孢菌素酰化酶）；头孢菌素IV(头孢菌素酰化酶)7-氨基脱乙酰氧头孢烷酸(7-青霉素V酰化酶）；脱乙酰头孢菌素(头孢菌素乙酸酯酶），近年还进行固定化产研究。(2)氨基酸工业拆分DL-氨基酸(氨基酰化酶；^酪氨酸及L-多巴(卜酪氨酸酶）；L*赖氨酸(二氨基庚二酸脱竣酶或氨基-e-己内酰氨水解酶和消旋酶）；尿刊酸(L-组氨酸氨解酶）士-天冬氨酸（天冬氨酸合成酶），L>丙氨酸(L-天冬氨酸-卜脱羧酶）；L-苯丙氨酸(L-苯丙氨酸氨解酶或苯丙氨酸转氨酶），L-谷氨酸(L-谷氨酸合成酶）；L-丝氨酸(转甲基酶），L-色氨酸(色氨酸合成酶）；谷氨酰胺(谷氨酰胺合成酶天冬酰胺（天冬酰胺合成酶谷胱甘肽(复合酶系）：Y-氨基丁酸(谷氨酸脱羧酶)等。(3)有机酸类药物L-苹果酸（延胡索酸酶），L(+)-酒石酸（环氧琥珀酸水解酶），乳酸(乳酸合成酶系或腈水解酶）；葡萄糖酸(葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶），长链二羧酸（加氧酶和脱氢酶），衣康酸(复合酶系）。(4)维生素类药物制造2-酮基-L-古龙糖酸（山梨糖脱氢酶及L-山梨糖醛氧化酶或2，5-DKG还原酶)；CoA(CoA合成酶系），肌醇(肌醇合成酶），L-肉毒碱(胆碱酯酶）。(5)甾体类药物制造氢化可的松（11-卜经化酶），脱氢泼尼松（类固醇-△-脱氢酶），睾丸激素(类固醇酯酶)等。(6)核苷酸类药物制造5-核苷酸(5'-磷酸二酯酶），ATP(氨甲酰磷酸激酶）或AMP(激酶加乙酸激酶）CDP胆碱（复合酶系），肌苷酸（腺苷脱氨酶），NAD(焦磷酸化酶)等。

2.2在医疗上的应用固定化酶在临床治疗上也有很好的应用前景，可涉及到心血管疾病，肿瘤及遗传病等众多疑难病症的治疗。由于外源性酶在体内易产生免疫反应，且稳定性差，又难于达到特定部位，因此固定化酶、人工细胞、脂质体及红细胞膜包埋酶工程技术在临床治疗中的应用日趋活跃。主要有：（1)将固定化酶应用于体内作为治疗药物；（2)将固定化酶组装成体外生物反应器，通过体外循环作为临床治疗剂。如用脲酶及脲酸酶以治疗肾衰竭与痛风症；用固定化胆红素氧化酶清除血中过高的胆红素；将L-天冬酰胺酶固定于中空纤维上进行体外血液循环，可用于治疗白血病等；将胰蛋白酶.、凝乳蛋白酶、溶菌酶、凝血酶及溶葡萄球菌酶等固定于膜上或纤维上制成辅料贴于伤口，可用于止血，防污染，抗炎，促进伤口愈合等。

作者：吴梧桐(中国药科大学生物技术研究中心）

第2篇：酶工程制药的研究

1药用酶的来源

酶作为生物催化剂普遍存在于动植物和微生物之中，可直接从生物体中分离获得。虽然也可以通过化学合成法合成，但由于各种因素的限制，目前药用酶的生产主要是直接从动植物中提取、纯化和利用微生物发酵生产。早期酶的生产多以动植物为原料，经提取纯化而得，接至至今有些酶仍然还用此法生产，如从猪顿严腺中提取激肪释放两、从菠萝中提取菠萝蛋白酶等。但随着酶制剂应用范围的日益扩大，单纯依赖动植物来源的酶，已不能满足要求.而几动植物原料的生长周期长、来源有限，又受地理、气候和季节等因素的影响，不宜十大规模生产。近十多年来，动植物细胞培养技术取得了很大的进步，但因周期长、成本高等问题，实际应用还有一定困难，所以目前工业大规模生产一般都以微小物为主要来源。

2药用酶的生化制

各法生化制备法的主要生产过程如下：选取符合要求的动植材料一生物材料的须处理一提取。

2.1原料选择应注意的问题生物材料和体液下虽普遍具有酶，但在数量和种类上不同材料却有很大的差别，组织中酶的总量虽然不少、仅各种酶的含量却非常少。从己有的资料看，个别酶的含量，因此在提取酶时应根据各种酶的分布特点和存在特性选择适宜的生物材料。

2.2生物材料的预处理生物材料中酶多存在于组织或细胞中，因此提取前需将组织或细胞破婶，以便酶从其中释放出来，利于提取。由于酶活性与其空间沟象有关，所以预处理时一般应避免剧烈条件；但如是结合酶，则必须进行剧烈处理，以利于酶的释放。生物材料的预处理方法有以下几种。

机械处理用绞肉机将事先切成小块的组织绞碎。当绞成组织糜后，许多面都能从颗粒较粗的组织糜中提取出来，但组织糜颗粒不能太粗，这就要选择好绞肉机板的孔径，若使用不当，会对产率有很大的影响。通常可先用粗孔径的机板绞，再用细孔径的机板绞，有时甚至要反复多绞几次。如是速冻的组织也可在冰冻状态下直接切块纹碎。采用绞肉机，一般并不能破碎细胞，而有的则必须在细胞破碎后才能有效地提取，对此则需采用特殊的匀浆工艺才行。实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器，工业上可用高压匀浆机。对于用机械处理仍不能有效提取的酶，可用下述方法处理。

反复冻融处理将材料冷冻到一10^左右，再缓慢溶解至室湿，如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成及剩余液体中盐浓度的增高，可使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使酶释放出来。

制备丙酮粉组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶的变性，同时因细胞结构的破坏使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中，如鸽子肝脏乙酰氧化酶就是用此法处理。常用的办法是将组织糜或匀浆悬浮于0.01molL。

磷酸缓冲液中，再在0弋下将其一边搅拌，一边慢慢倒入10倍体积的一15^无水丙酮内，10mol后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。

3酶的提取

3.1水溶液法常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料，包括组织糜、匀浆、细胞颗粒以及丙酮粉等，都可用水溶液抽提。为了防止提取过程中酶活力降低，一般在低温下操作；但对温度耐受性较高的酶(如超氧化物歧化酶)，却应提高温度，以使杂蛋白变性，利于酶的提取和纯化。

水溶液的PH选择对提取也很重要，应考虑的因素有：酶的稳定性、酶的溶解度、酶与其他物质结合的性质。选择pH的总原则是：在酶稳定的pH范围内，选择偏离等电点的适当PH。

3.2有机溶剂法某些结合酶，如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。

丁醇具有下述性能：亲脂性强，特别是亲磷脂的能力较强；兼具亲水性，在水中的溶解度为10.5%；在脂与水分子间能起表面活性剂的桥梁作用。

用丁醇提取方法有两种。一种是均相法：用丁醇提取组织的匀浆然后离心，取下相层，但多酶在与脂质外离后极不稳定，需加注意。

另一种是二相法：在每克组织或曲体的干粉中加5m1丁醇，搅拌20mm，离心，取沉淀(注意：均相法是取液相，二相法是取沉淀)，接着用丙酮洗去沉淀上的丁醇，再在真空中除去溶剂，所得干粉可进一步用水提取。

4酶的纯化

酶的纯化是一个复杂的过程，不同的曲，岗件质不问，其纯化工艺可有很大不同。评价一个纯化工艺的好坏，主要看两个指标：一是酶比活，二是总活力回收率。设计纯化工艺时应综合考虑上述两项指标。

作者：孙丽娜(黑龙江金九药业股份有限公司，黑龙江密山158306）