第一篇：蜈蚣提取物抗肺癌活性的体内外实验研究
肺癌已成为全球严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤，其发病率和病死率位居首位[1]。肺癌属中医“肺积”“咳嗽”“积聚”等范畴。徐振晔认为本病最基本的病理机制是癌毒痰瘀胶结于肺部，实证多为毒聚、痰凝、气滞、血瘀[2]。刘伟胜提出肺癌发病基础是正虚，直接因素是癌毒，治宜扶正配以软坚散结、清化瘤毒[3]。胡国良认为，凡肿瘤皆邪气密结不散，属实证，主张攻补兼施，攻以峻猛攻毒散结，补以甘温补益[4]。虫类药抗肿瘤作用一直颇受关注，蜈蚣作为一种重要的虫类药物，其攻毒散结的功效在临床治疗肺癌中药复方配伍中应用广泛[5-6]。本实验对蜈蚣有效成分的分离纯化、抗肺癌活性进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级纯系BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠30只，4～6周龄，体质量（20±3）g，重庆斯莱康动物药业有限公司，许可证号SCXK（湘）2009-0004。饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF级实验室。
1.2 细胞株
人肺癌A549细胞株，购于湘雅医学院细胞中心。用含12%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基，置37 ℃、5%CO2饱和湿度的恒温孵育箱中培养。
1.3 药物及制备
少棘蜈蚣，湖南中医药大学第一附属医院药剂科，提取物制备参照文献[7]方法改进。蜈蚣超微粉末2 g，55 ℃蛋白酶酶解后，99 ℃水浴中灭活10 min，4 ℃、5000 r/min离心10 min，取上清液，2倍体积预冷丙酮沉淀，4℃、5000 r/min离心10 min，取沉淀，超纯水充分溶解沉淀，重复2次。收集最后沉淀，超纯水溶解，加2倍体积预冷丙酮，取沉淀，30 ℃真空干燥成粉末，-20 ℃冻存备用。顺铂，齐鲁制药有限公司，批号5110351DB。
1.4 主要试剂及仪器
高糖DMEM培养基（美国GIBCO公司），FBS（美国INVITROGEN公司），磷酸盐缓冲液（PBS，武汉博士德有限公司），二甲基亚砜（DMSO，美国AMRESCO公司），噻唑蓝（MTT）、Hoechst33342荧光染料（美国SIGMA公司）。CO2培养箱（美国Therrmo公司），Elx808型酶标仪（美国BioTek公司），BX20型荧光显微镜摄像机（日本Olympus公司），FACScan型流式细胞仪（美国BD公司）。
1.5 细胞增殖抑制率测定
取对数生长期A549细胞制成单细胞悬液，调整浓度为5×104个/mL，接种于96孔板，每孔200 μL，蜈蚣提取物干预设置7个浓度梯度（2.500、1.250、0.625、0.313、0.15、0.078、0.039 mg/mL），同时设对照组和空白组（调零孔），均设5个复孔，其中对照组接种细胞加入完全培养基，空白组只加入完全培养基。MTT法检测参照说明进行，计算细胞生长抑制率（%）[1-（OD值药物组÷对照组OD值）]×100%，采用直线回归方程计算半数抑制率（IC50）。
1.6 细胞凋亡及细胞周期检测
取对数生长期A549细胞，浓度为1×105个/mL，接种于6孔培养板中，设置蜈蚣提取物组和对照组，其中蜈蚣提取物组加入IC50浓度药液处理，对照组加入等量完全培养基，每孔2 mL。蜈蚣提取物处理48 h后流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期。Hoechst荧光染色观察细胞凋亡形态。
1.7 人肺癌裸小鼠皮下移植瘤模型制备
取对数生长期A549细胞，浓度为1×107个/mL，接种于裸小鼠背部皮下，每只0.2 mL，接种后第7日成瘤。将30只裸小鼠随机分为模型组、蜈蚣提取物组、顺铂组，每组10只。接种后第8日给予药物灌胃，动物给药量按人和动物体表面积折算为成人5倍剂量。取蜈蚣提取物12 mg加入生理盐水至8 mL，配成含0.06 g原药材/mL药液，每次灌胃0.4 mL/只，2次/d；顺铂组予2 mg/kg剂量腹腔内注射，1次/3 d；模型组予等剂量生理盐水灌胃。连续18 d。各组小鼠治疗后第19日脱颈处死。实验过程中观察动物一般的状况，绘制肿瘤体积增长曲线并计算其抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量）÷模型组平均瘤质量×100%。
1.8 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，2组间比较采用成组t检验；多组比较采用方差分析，组间比较采用SNK法。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
蜈蚣提取物组动物给药期间饮食、精神可，对外界刺激反应灵敏，大小便正常；顺铂组给药后第4日出现饮食减少，精神尚可，对外界刺激反应尚灵敏，大便稍溏，小便正常；模型组第3日后开始出现消瘦，精神欠佳，对外界刺激反应不灵敏，饮食饮水量减少，大便溏，小便正常。
2.2 蜈蚣提取物对人肺癌A549细胞增殖抑制、细胞周期及诱导凋亡的影响
MTT法检测结果显示，蜈蚣提取物对人肺癌A549细胞增殖有明显抑制作用（P<0.05），呈剂量依赖性。蜈蚣提取物增殖抑制率回归方程为：Y=24.807X+35.174。经计算IC50为0.603 mg/mL。以IC50浓度蜈蚣提取物作用于人肺癌A549细胞48 h后，与对照组比较，G0/G1期细胞百分含量下降，S期与G2/M期细胞比例均升高（P<0.05）。Hoechst荧光染色结果显示，蜈蚣提取物处理后A549细胞出现核染色质浓缩、凝聚，密度升高，细胞核被致密浓染，出现颜色发白等特征性凋亡表现，见图1。流式细胞仪检测结果显示，蜈蚣提取物组可见大量细胞凋亡，凋亡率达63.48%。结果见表1。
2.3 蜈蚣提取物对人肺癌A549细胞裸小鼠皮下移植瘤瘤体体积、质量及抑瘤率的影响
灌胃过程中测量皮下移植瘤第8、16、25日体积，蜈蚣提取物组分别为（126.0±11.2）、（171.5±13.3）、（196.0±20.8）mm3，顺铂组分别为（113.7±8.9）、（134.5±9.1）、（183.8±13.5）mm3，模型组分别为（320.0±24.6）、（786.5±31.1）、（1912.5±56.4）mm3，蜈蚣提取物组和顺铂组皮下移植瘤体积生长速度较模型组明显减慢（P<0.01），见图2。给药18 d后，蜈蚣提取物组皮下移植瘤瘤体质量为（2.94±0.76）g明显低于模型组[（4.65±0.91）g]（P<0.05）；与顺铂组[（2.52±0.69）g]比较无明显差异；蜈蚣提取物组抑瘤率为36.77%较顺铂组45.81%比无明显差异。
3 讨论
蜈蚣是我国传统名贵中药材，现代药理研究显示，蜈蚣具有降低血黏度、抗炎、抗菌、镇痛、抗惊厥等多种作用[8]。蜈蚣具有“攻毒散结”的功效特点，以复方配伍的形式应用于恶性肿瘤的临床治疗[9-12]。
本研究对蜈蚣抗肺癌活性进行系列体内外实验，结果表明，蜈蚣提取物呈剂量依赖性抑制人肺癌A549细胞增殖，对肺癌细胞周期的影响主要表现为明显的G2/M期阻滞作用，使细胞有丝分裂受阻，阻碍DNA合成，促使其凋亡。体内裸小鼠皮下移植瘤实验结果也提示，蜈蚣提取物能减缓肿瘤生长速度，抑瘤率达36.77%，其疗效与顺铂45.81%比较差异无统计学意义。
综上所述，蜈蚣提取物体外可抑制肺癌细胞A549的增殖并诱导其凋亡，体内可抑制皮下移植瘤的生长速度，显示蜈蚣具有良好的抗肺癌活性。
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中国中医药信息 2016年5期 作者：陈园 艾小佳 王志琪 田莎 周青 裴刚 田雪飞
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