【关键词】 Biglycan; 地塞米松; 血管平滑肌细胞; 钙化
Effect of Biglycan on Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells Induced by Dexamethasone
LU Li-he1， LIU Lan2， TAN Hong-mei1， ZHANG Xuan-hong1
(1. Department of Pathophysiology， Zhongshan School of Medicine， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510080， China;
2. Department of Pathology， Yunnan Medical College， Kunming 650031， China)
Abstract： 【Objective】 To investigate the molecular mechanism of vascular smooth muscle cells (VSMCs) calcification induced by dexamethasone (Dex). 【Methods】 VSMCs were induced by Dex to detect the expression of biglycan (BGN). Through 10-8 mol/L Dex induction， BGN recombined VSMCs infected by adenovirus/BGN (Ad/BGN) or empty adenovirus (Ad/Bgl) to detect the calcification rate of VSMCs， the expression of BGN， osteocalcin， cbfa1， and bone morphogenetic protein 4 (BMP4) respectively. Cells were divided into four groups (n = 3)： Ad/Bgl-BGP group： VSMCs were infected with Ad/Bgl; Ad/BGN-BGP group： VSMCs were infected with Ad/BGN; Ad/Bgl-Dex group： VSMCs were infected with Ad/Bgl induced by Dex; Ad/BGN-Dex group： VSMCs were infected with Ad/BGN induced by Dex. 【Results】 After transfected by Ad/BGN， the calcification of VSMCs enhanced， and the protein expression of osteocalcin， cbfa1， and BMP4 increased significantly compared with those in cells infected with Ad/Bgl. The protein expression of osteocalcin， cbfa1， and BMP4 in VSMCs infected with Ad/BGN induced by Dex increased even more. 【Conclusion】 BGN can accelerate the calcification of VSMCs induced by dexamethasone.
Key words： biglycan; dexamethasone; vascular smooth muscle cells; calcification
血管钙化过程是一个与骨形成过程相似的可调控的生物学过程，其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)是参与血管钙化的主要细胞。当血管平滑肌细胞受到促钙化因素的刺激如糖皮质激素水平升高，氧化应激，钙磷代谢紊乱等等，血管平滑肌细胞分化为具有成骨细胞特征样的细胞，分泌大量的骨相关蛋白(bone-related proteins)。目前已证实地塞米松(dexamethasone， Dex)能呈时间和剂量依赖性地促进血管钙化，并上调核心结合因子α1(cbfa1)的表达[1]。然而，促使VSMCs向成骨细胞样分化的分子基础尚不清楚。研究表明，一种富含亮氨酸的双链蛋白聚糖(biglycan，BGN)参与骨形成，促进成骨前体细胞向成骨细胞分化[2]。本实验旨在通过观察BGN在VSMCs对地塞米松诱导的钙化过程中的作用，从BGN途径初步探讨地塞米松导致的VSMCs钙化的分子机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
DMEM培养液(Sigma， USA)，100 mL/L胎牛血清(Sigma， USA)，Biglycan ( Sigma， USA)，Ad/BGN(曼彻斯特大学心血管病实验室惠赠)。
1.2 建立VSMCs钙化体外模型
取截肢病人的动脉，无菌操作切成小块，于含10% FBS 的DMEM中，37 ℃，体积分数5%CO2培养，每周换液3次。用细胞免疫荧光的方法鉴定VSMCs：α-SM-actin 作为VSMCs的分子标志物，vWF为血管内皮细胞的标志物，确保所得的细胞为VSMCs，排除血管内皮细胞的污染。以β-甘油磷酸(beta-glycerophosphate，BGP)加地塞米松(Dex)诱导其钙化。实验分3组：control：正常对照组，培养液为DMEM。BGP组：培养液为DMEM + 10 mmol/L BGP。BGP+Dex组：培养液为DMEM + 10 mmol/L BGP + 10-8 mol/L Dex。以Western blot方法检测BGN的表达。
1.3 Ad/BGN感染VSMCs
将VSMCs接种到六孔板，待其长到80%confluence时用不同浓度的表达报告基因的Ad/Laz(携带LacZ基因的重组腺病毒)(MOI = 0， 10， 50， 100， 150， 300)感染细胞，再用X-gal染色以确定最佳浓度供以后的Ad/BGN转染实验使用。最佳的浓度应该是染色的细胞比例达100%，同时没有细胞损伤。选择3-8代的VSMCs，分4组：Ad/Bgl-BGP组：培养液为DMEM + 10 mmol/L BGP，用空载体Ad/Bgl感染细胞。Ad/BGN-BGP组：培养液为DMEM + 10 mmol/L BGP，用含目的基因的载体Ad/BGN感染细胞。Ad/Bgl-Dex组：培养液为DMEM + 10 mmol/L BGP + 10-8 mol/L Dex。用空载体Ad/Bgl感染细胞。Ad/BGN-Dex组：培养液为DMEM + 10 mmol/L BGP + 10-8 mol/L Dex。用含目的基因的载体Ad/BGN感染细胞。在腺病毒感染细胞后第14天观察以下指标。
1.4 Ad/BGN转染对VSMCs钙化的影响
平滑肌细胞去除培养液，PBS洗3次后以40 g/L甲醛室温下固定10 min，PBS洗后加茜素红(pH4.2)染色5 min，去离子水洗3次，相差显微镜观察钙沉积。
1.5 Western-blot测定BGN、骨钙数、cbfa1和BMP4蛋白的水平
收集细胞，PBS洗3次，加超声裂解缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4， 100 mmol/L Tris-HCl， 250 mmol/L NaCl， 100 mg/L， PMSF1 mg/L， Aprotitin， pH 8.0)，200 ～ 300 W超声裂解10次，每次10 s，间隔10 s。12 000 r/min(r = 10 cm) 4 ℃离心40 min，上清即为总蛋白粗提液。 用Bio-rad标准曲线定量蛋白，总蛋白40 μg加等体积2 × 上样缓冲夜混匀后煮沸变性5 min，120 g/L十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干法转至醋酸纤维膜; 室温下脱脂奶粉封闭2 h后加封闭液和BGN、骨钙素(Osteocalcin)、cbfa1、骨形态生成蛋白4(bone morphogenic proteins 4， BMP4)以及β-actin的一抗、二抗于室温下共同孵育1 h。将滤膜转移到Tris-Cl 中温育10 min，辣根过氧化物酶显色，拍照。
1.6 统计学处理
每次实验重复3次。采用SPSS系统软件中的One-way ANOVA检验分析并处理相关数据。P < 0.05被认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 地塞米松对血管平滑肌细胞的BGN表达的影响
较之培养液不含BGP和Dex的正常对照组和不含Dex的BGP组，地塞米松诱导组(BGP + Dex)VSMCs的BGN表达明显增加(图1)。
2.2 Ad/BGN感染血管平滑肌细胞的浓度
不同浓度的Ad/LacZ感染血管平滑肌细胞后，LacZ(β-半乳糖苷酶基因)的表达呈剂量依赖性增加(图2)。
2.3 BGN对血管平滑肌细胞钙化的影响
Ad/BGN转染后，对于单纯BGP诱导的VSMCs(图3A、B)，可见其Ad/BGN后钙化程度有所加强;对于地塞米松加BGP诱导的VSMCs(图3C、D)，同样可观察到Ad/BGN转染较之空载体Ad/Bgl感染的细胞钙化增加。
2.4 BGN对血管平滑肌细胞中osteocalcin、cbfa1、BMP4蛋白水平的影响
Ad/BGN转染后(图4B、D)，VSMCs的osteocalcin、cbfa1 和BMP4蛋白水平较之相应对照组表达明显增多(图4A、C)。加地塞米松诱导后，Ad/BGN转染的VSMCs(图4D)，其BGN蛋白的表达量较未加地塞米松的相应对照组(图4B)有显著增加。
3 讨 论
BGN是一种富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycans， SLRPs)家族成员，属于细胞外基质蛋白(extracellular matrix protein)。BGN主要在结缔组织中表达，在骨和软骨细胞的表面和细胞外基质中高表达[3]。本研究证实了BGN在地塞米松诱导的VSMCs钙化中表达增加，且重组BGN腺病毒载体转染平滑肌细胞内可促进地塞米松诱导的钙化作用。
3.1 血管平滑肌细胞及糖皮质激素在血管钙化中的可能作用
VSMCs在不同的条件下存在不同的表型，包括收缩型，分泌型以及成骨细胞样型[4]。VSMCs具有很强的可塑性，细胞外周环境的变化可促使其表型的转变[5]。当血管平滑肌细胞受到促钙化因素的刺激如糖皮质激素水平升高，氧化应激，钙磷代谢紊乱等，VSMCs分化为具有成骨细胞特征样的细胞，分泌大量的骨相关蛋白，如cbfa1，BMP，Osteocalcin等[6]。VSMCs又是参与血管钙化的主要细胞。因此，血管钙化过程很可能就是VSMCs由收缩型向成骨细胞样型分化(osteoblastic differentiation)的过程。
糖皮质激素是肾上腺皮质合成的类固醇激素。体内和体外实验提示糖皮质激素是血管钙化的诱导因子。尽管糖皮质激素能诱导骨质疏松，但是它同样能促进血管钙化。体外实验证实糖皮质激素能诱导糖皮质激素能诱导骨髓基质细胞，成纤维细胞，以及血管平滑肌细胞向成骨细胞方向分化，调节骨相关蛋白的表达[2，7]。以上研究结果表明糖皮质激素是强力的血管钙化诱导因子，但其促使血管钙化的机制并不完全清楚。
3.2 BGN参与地塞米松诱导血管平滑肌细胞钙化的作用机制探讨
研究表明，BGN参与骨形成，促进成骨前体细胞向成骨细胞分化[2]。小鼠BGN基因敲除实验表明，缺乏BGN的表达会导致骨质疏松，骨形成受影响[2]。由于血管钙化过程与骨形成过程很相似，提示BGN有可能与血管钙化密切相关。此外，近来研究发现Decorin能促进VSMCs钙化，并且在动脉粥样斑块钙化区有高表达[8]。而BGN的结构和功能与Decorin十分相似。此外，Moreno等[9]的动物实验结果表明，在蟾蜍胚胎中BGN可与BMP4结合并调节其生物学活性。因此我们有理由相信BGN很有可能也参与血管钙化，其机制可能与BGN调节骨形态生成蛋白(bone morphogenic proteins， BMPs)的活性有关。已有实验证明，BGN可通过调节BMPs信号途径诱导骨细胞向成骨细胞分化，并导致细胞外基质钙化[10]。另外，有研究报道地塞米松可诱导人肾系膜细胞中BGN表达增加[10]。结合上述我们的研究成果，我们推测地塞米松诱导的VSMCs钙化的机制可能是：地塞米松能上调BGN的表达，BGN通过激活BMP4通路，导致VSMCs向成骨样细胞分化，最终形成钙化。
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