【关键词】 辛伐他汀;CD40;IFNγ;单个核细胞;急性冠状动脉综合征
Effects of Simvastatin on Expression of CD40 in Peripheral Blood Mononuclear Cells Induced with IFNγ TIAN Caixia1,QIN Weichao1,WANG Jianing2,QIU Fangcheng1,LIU Tangxin3*(1Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital,2Institute of Clinical Medcine,Renmin Hospital,3Department of Orthopedics,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)
Abstract:Objective To explore the change of CD40 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMNC) with induction of IFNγ,and the effects of simvastatin on expression of CD40 induced with IFNγ in PBMNCs with different s Fortytwo healthy volunteers were enrolled,PBMNCs were separated from heparinized venous blood by density gradient centrifugation and then cultured with 100 μg/L IFNγ or 20 μmol/L simvastatin for 24 CD40 expression level was determined by flow pes of the CD401C/T were assayed by polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphism(PCRRFLP).The expression levels of CD40 in PBMNC with different genotypes were s The levels of CD40 expression without intervention was increased after 24 h,however,there was no significant difference among CC,CT and TT genotypes (P>0.05).The levels of CD40 expression in PBMNC in all genotypes were increased significantly after induction with IFNγ and culture for 24 h,and the increase extent of CC genotype was significant higher than that of the other genotypes(P<0.05).Simvastatin could significantly inhibited the expression of CD40 in PBMNC induced with IFNγ,while the inhibitory effects of Simvastatin had no significant difference among different sion CD401C/T polymorphism could influence the CD40 expression of PBMNC,Simvastatin could markedly inhibit the expression of CD40 in PBMNCs induced with IFNγ,but there was no significant difference in the protective effects of Simvastatin among different genotypes of PBMNCs.
Key words:Simvastatin;CD40;IFNγ;Mononuclear cell;Acute coronary syndrome
最近的研究[1]发现,他汀类药物除具有调脂作用外,还具有抗炎症反应作用。CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,具有所有炎性因子的共同特征。药物基因组学研究认为[2],基因表型与药物疗效之间存在着明显关系。辛伐他汀是否影响CD40的表达及对不同基因表型个体的抗炎效应是否相同还不清楚。本文探讨经干扰素γ(IFNγ)干预后,辛伐他汀对CD40表达的调节作用,并进一步探讨其对携带CD40不同基因表型的单个核细胞表达CD40的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选择郧阳医学院附属人民医院体检保健科的健康志愿者42例,均经体检及实验室检查排除任何感染症状和炎症状态,平均年龄(25.43±3.15)岁,其中男30例,女12例。
1.2 外周血单个核细胞的分离及培养
采集健康志愿者外周静脉血16 mL,EDTANa2抗凝,用PBS缓冲液1∶1稀释,轻轻颠倒试管混匀。用尖头吸管将稀释血轻轻平铺于离心管内的淋巴细胞分离液表面(比重1.007),稀释血与淋巴细胞分离液体积比为2∶1,可见二者间形成清晰界面,室温下水平式离心机2 000 r/min离心20 min,离心后单个核淋巴细胞呈白膜状悬于分离液层与红细胞层之间,用尖头吸管小心吸取单个核淋巴细胞层至新的离心管,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液洗涤2次(室温下水平式离心机1 500 r/min离心10 min),将清洗后的细胞重悬于RPMI 1640培养液中(含10%胎牛血清、1 nmol/L谷氨酰胺、105U/L青链霉素),取0.1 mL,台盼兰染色,显微镜下计数活细胞比率,要求>95%。
将细胞接种于培养皿中,置于37 ℃ 5%CO2培养箱孵育2 h后,吸出培养液,用37 ℃预热的新鲜培养液清洗3次,洗脱未贴壁细胞,贴壁细胞即主要为单核细胞。瑞氏染色鉴定贴壁细胞中单核细胞比率占85%以上。将贴壁细胞用细胞刮片轻轻刮下,重悬于RPMI 1640培养液中,调整细胞浓度为1×106/mL,并接种于24孔培养板,2 mL/孔。
1.3研究对象CD401C/T单核苷酸多态性基因分型
改良的碘化钠法提取模板DNA,聚合酶链反应扩增包含1C/T位点的特异性片段,扩增产物用5U限制性内切酶NcoⅠ酶切,37 ℃反应6 h,反应终止后,消化片段用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶(EB)染色,紫外灯下观察。
1.4实验分组
给予100 μg/L IFNγ干预作为刺激状态组,以20 μmol/L辛伐他汀先与单个核细胞共孵育1 h,再给予100 μg/L IFNγ刺激为辛伐他汀干预组,24 h后用流式细胞仪检测培养的单个核细胞表面CD40的表达水平。
1.5统计学分析
计量资料用x±s表示,两样本之间计量资料比较用两独立样本t检验,多样本之间计量资料比较用单因素方差分析,所有数据均在SPSS11.5软件包上分析,P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 研究对象基本资料
42例研究对象按照CD401C/T位点基因型分为CC基因型(13例),CT基因型(24例)和TT基因型(5例)。研究对象的临床和生化特征见表1,可见三种基因型研究对象间性别、年龄、BMI、收缩压、舒张压、血糖、TC、TG、LDLC、HDLC、apoAI、apoB等差异无统计学意义(P均>0.05)。表1 42例不同基因型研究对象间临床和生化特征的比较
2.2基础状态下CD40基因1C/T多态性对单个核细胞表达CD40的影响
基础状态下,三种基因型单个核细胞培养24 h后,细胞表面CD40表达量均显著升高。CC、CT、TT三种基因型单个核细胞在0 h CD40表达量无显著性差异,培养24 h后,三种基因型单个核细胞CD40表达水平也无显著性差异,见表2。表2 基础状态下不同基因型单个核细胞表达CD40水平的比较(x±s,MFI)
2.3 IFNγ刺激状态下CD40基因1C/T多态性对单个核细胞表达CD40的影响及辛伐他汀的干预作用
100 μg/L IFNγ刺激状态下,单个核细胞培养24 h后CD40表达量呈显著升高水平,不同基因型单个核细胞CD40表达上升的幅度有显著性差异,分别为CC型上升6.41倍,CT型上升3.68倍,TT型上升2.35倍,20 μmol/L辛伐他汀显著抑制经IFNγ诱导后CD40的表达,然而对不同基因型单个核细胞的抑制程度没有显著性差异,对CC、CT、TT型的抑制率分别为46.4%、39.6%、36.8%。表3 三种状态下不同基因型单个核细胞培养24 h后表达CD40水平的比较(x±s,MFI)
3 讨论
急性冠状动脉综合征(Acute Coronary Syndrome,ACS)是以动脉粥样硬化斑块破裂或糜烂,继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征,炎症反应的激活可能是发生ACS的因素之一。最新的研究证实[3],炎性细胞因子CD40在ACS发生发展过程中起到了激活炎症细胞、启动炎症反应的作用,是介导这一炎症反应的重要介质。在正常情况下,血管内皮具有抵抗白细胞浸润的能力,并且只少量表达CD40,血管内皮受到损伤时,如干扰素γ(IFNγ)的刺激下,CD40大量表达,并与其配体CD40L结合,进而激活粥样斑块中的巨噬细胞、内皮细胞以及T淋巴细胞分泌黏附分子、细胞因子(IL6、TNFα、IFNγ等)、基质金属蛋白酶和组织因子等[4]。因此,CD40CD40L的激活能加速动脉粥样硬化的发生发展,并触发斑块不稳定,裂缝形成,甚至破裂,导致ACS的发生。
激活的单核/巨噬细胞是CD40的重要来源之一,机体单个核细胞不仅容易获取、分离、培养,而且被激活后可与内皮细胞粘附并向内皮下迁移,这也是动脉粥样硬化发生的首要步骤。IFNγ可诱导单个核细胞募集,促进泡沫细胞和指纹形成,促进血管壁细胞产生炎性因子,还可显著促进单核细胞分泌CD40[5]。
我们的体外实验证实,经IFNγ刺激后,单个核细胞大量表达CD40,这与国外报道相一致[6]。IFNγ是ACS炎症反应中关键的介质之一,也是调节CD40生成的主要因子,实验结果提示,IFNγ能直接激活人外周血单个核细胞,参与机体的炎症反应。
基因组的变异是普遍存在的,且绝大多数变异都不具功能性,没有生物学意义,不影响基因表达产物的功能或表达水平。我们在前面的研究[7]中发现中国湖北地区汉族人群CD40基因启动子上游1位点存在单核苷酸C和T的互换,但此多态性在中国人中是否具有功能性、是否影响CD40基因的转录或翻译效率,尚需探讨。本实验发现携带CD40不同基因表型的单个核细胞经IFNγ刺激后,CD40表达上升的幅度有显著性差异, CC基因型上升的幅度最大,CT基因型次之,TT基因型上升幅度最小,据此可推测CD401C/T基因多态性可能在某种程度上影响CD40的表达。目前尚不明确CD40基因1C/T多态性影响CD40基因转录效率或翻译效率的机制,推测可能CD40基因1C/T多态性通过一些未知的DNA结合序列影响CD40基因的转录或翻译,也有可能该多态性并不真正影响CD40基因的转录,只因与CD40基因中另一个有功能的多态性连锁而得出上述结论。IFNγ可促进单核/巨噬细胞合成TNFα、ILβ及表达NFκB,我们在研究中虽没有检测这些因子的表达水平,但不排除CD40基因1C/T多态性通过与这些炎性因子的相互作用影响单个核细胞表达CD40效率的可能。CD40基因的转录和翻译调控复杂,启动子区任何微小的变异都有可能影响该系统的调节,要完全了解CD40基因1C/T多态性的功能需进行单体分析及分析与各种转录因子的共同作用。
随着分子生物学的发展和人类基因组计划的完成,药物基因组学成为研究的热点,不同患者对同一种药物的作用效果和药物代谢可能存在差异,而这种差异可能是由不同患者所携带的基因型不同引起的。他汀类药物是临床上常用的治疗冠心病的药物,具有很好的调脂和抗炎疗效[8]。本研究用20 μmol/L辛伐他汀观察其对单个核细胞表达CD40的调节作用,并进一步探讨其对不同基因表型单个核细胞的影响,发现辛伐他汀可显著抑制IFNγ诱导的CD40的表达,但在不同基因型单个核细胞中,辛伐他汀的抑制效率没有显著性差异,对CC、CT、TT型的抑制率分别为46.4%、39.6%、36.8%。本研究在体外证实了辛伐他汀的抗炎作用,下一步我们将探讨在非炎症状态下,即单一辛伐他汀处理细胞,观察其对基础状态下单个核细胞的影响。
综上所述,经辛伐他汀处理后,炎症因子CD40大幅度下降可以初步反映临床上ACS患者在他汀类药物治疗后的良好效应,提示应激状态下单个核细胞对早期他汀药物干预反应良好,炎症活动减弱,有助于斑块钝化,然而在临床上对不同基因型的患者使用辛伐他汀治疗,在抗炎效果上可能没有差异。
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