【关键词】甲基亚砷酸(mmaⅲ)；砷中毒；enos磷酸化；活性氧自由基(ros)
摘要：目的观察无机砷的活性中间产物甲基亚砷酸(mmaⅲ)对牛主动脉血管内皮细胞(baec)的内皮型一氧化氮合酶(enos)磷酸化以及活性氧自由基(ros)产生的影响。方法培养的baec分别暴露于mmaⅲ(075μmol/l，0～15min)；亚砷酸钠(iasⅲ，100μmol／l，0～60min)；或n乙酰半胱氨酸（nac，1mmol／l)预处理2h后，再暴露于mmaⅲ(075μmol／l，0～15min）。收获细胞悬液进行enos磷酸化蛋白的westernblot分析；应用二氯二乙酰荧光素法(h2dcfda)观测细胞内的ros产生。结果baec暴露于mmaⅲ(075μmol／l)15min后，enosser1179磷酸化显著增加（p<005)，nac预处理(1mmol／l)能够抑制这一现象；iasⅲ暴露也能够诱导enosser1179磷酸化（p<005)，但是需要高浓度和更长的暴露时间(100μmol／l，30min)；mmaⅲ(075μmol／l)暴露能够诱导baec产生ros，nac预处理(1mmol／l)能够抑制这一现象。结论mmaⅲ暴露能够诱导细胞内产生ros以及ros依赖性enos磷酸化。
关键词：甲基亚砷酸(mmaⅲ)；砷中毒；enos磷酸化；活性氧自由基(ros)
studyonenosphosphorylationinducedbymonomethylarsonousacid
libing,wangyi,sunguifan.
departmentofoccupationalhealth,schoolofpublichealth,chinamedicaluniversity(shenyang110001,china)
abstract：objectivetoobservetheeffectsofmonomethylarsonousacid(mmaⅲ)onenosphosphorylationandreactiveoxygenspecies(ros)generationinbovineaorticendothelialcells(baec).methodsculturedbaecwasexposedtommaⅲ(075μmol/l,0～15min)withoutorwithacetylcysteine(nac)pretreatment(1mmol/l,2h),oriasⅲ(100μmol/l,0～60min).wellularrosgenerationwasassessedwiththefluorescentprobe,2',7'dichlorodihydrofluoresceindiacetate(h2dcfda).resultsmmaⅲ(075μmol/l)causedarapidincreaseinphosphorylatedenosser1179at15minafterexposure(p<005).incontrast,upto100μmol/liasⅲcausedtheincreaseofphosphorylatedenosser1179at30min(p<005).mmaⅲemmaⅲinducedenosser1179phosphorylationandrosgenerationwereblockedbynacpretreatment(1mmol/l,2h).conclusionmmaⅲexposurecaninducerosgenerationandrosdependentenosphosphorylation.
keywords：monomethylarsonousacid(mmaⅲ);arsenicpoison;enosphosphorylation;reactiveoxygenspecies(ros)
无机砷的体内代谢中间产物甲基亚砷酸(mmaⅲ)比无机砷的细胞毒性和遗传毒性更强〔1〕，因此其毒性效应是砷中毒发病机制研究的一个新热点。研究表明，无机砷能够激活人类角质细胞和白血病jurkat细胞的内皮型一氧化氮合酶(enos)磷酸化〔2，3〕，还可以诱导产生h2o2和超氧阴离子自由基(o・-2)等活性氧自由基(ros)〔4〕。本研究观察mmaⅲ对牛主动脉血管内皮细胞(baec)的enos磷酸化以及ros产生的诱导作用。
1材料与方法
11主要试剂和仪器mmaⅲ(ch3aso，获赠自加拿大cullenwr实验室)；亚砷酸钠(iasⅲ，wako)；n乙酰半胱氨酸(nac，wako)；二氯二氢二乙酰荧光素(h2dcfda，molecularprobes)；co2细胞培养箱(kendro)；电泳仪和转膜装置(atto)；共聚焦荧光显微镜(leicamicrosystems)。
12细胞培养baec培养于高糖培养基（dmemf12)(sigma)，添加成分包括10％胎牛血清、10u/ml青霉素和100μg/ml链霉素、10u/ml肝素和5ng/ml成纤维细胞生长因子。37℃，5％co2常规培养。
13enos磷酸化的westernblot分析暴露因素包括mmaⅲ(075μmol/l，0～15min)；iasⅲ(100μmol／l，0～60min)；或nac(1mmol／l)预处理2h后，再暴露于mmaⅲ(075μmol／l，0～15min)。加入细胞裂解液收获细胞悬液，低温离心后取上清冻存备用。十二烷基磺酸钠（sds）聚丙烯酰胺凝胶后进行蛋白印迹（westernblot）分析。特异性一次抗体为抗phosphoenosser1179抗体和抗enos抗体(分别1：1000稀释)；特异性二次抗体为hrp标记的抗兔或抗小鼠二次抗体。自显影胶片扫描后用adobephotoshop701软件处理输出，并进行定量分析。共进行独立实验3次。
14细胞内ros产生的荧光测定应用荧光染料h2dcfda。具体实验步骤为：80％融合的baec细胞加入5μmol／lh2dcfda孵育20min后暴露mmaⅲ(075μmol／l，0～15min)；或nac(1mmol／l)预处理2h的最后20min加入h2dcfda共同孵育，然后暴露于mmaⅲ(075μmol／l，0～15min)。用倒置荧光显微镜观测细胞内的ros产生。激发光和发射光波长分别为480和527nm。共进行独立实验3次。
15统计分析应用spss100统计软件进行单因素方差分析和q检验。
2结果
21mmaⅲ或iasⅲ暴露对enosser1179磷酸化的影响baec暴露于075μmol／lmmaⅲ15min后，enosser1179磷酸化显著增加（p<005)，为对照组的141倍(图1)。而相同实验条件下，100μmol／liasⅲ暴露30min才可诱导enos
a：westernblot的典型结果
图1mmaⅲ暴露对enosser1179磷酸化的诱导作用（略）
a：westernblot的典型结果
图2iasⅲ暴露对enosser1179磷酸化的诱导作用（略）
22mmaⅲ暴露诱导ros依赖性enosser1179磷酸化和细胞内ros产生nac预处理(1mmol／l)抑制mmaⅲ(075μnol／l)暴露诱导的enosser1179磷酸(图3)。dcf荧光检测法表明，mmaⅲ(075μmol／l)暴露确实能够诱导baec产生蓝绿色荧光，提示有ros的生成，并且nac预处理(1mmol／l)后，蓝绿色荧光显著减弱，提示ros生成可以被抑制。
图3nac预处理抑制mmaⅲ暴露诱导的enosser1179磷酸化（略）
3讨论
ser1179是enos分子2个最重要的磷酸化位点之一。研究表明，ser1179磷酸化通过在ser1179基团增加一个负电荷而增加enos还原酶区域的电子流动、以及降低钙调蛋白―enos复合物解离这两个方面，引起enos活化〔5〕。enos磷酸化对于机体的enos活化具有重要作用。本研究发现，075μmol／lmmaⅲ暴露15min后，enosser1179磷酸化显著增加，提示mmaⅲ暴露初期可能诱导体内的enos活化。iasⅲ暴露也能够诱导enosser1179磷酸化，但是需要高浓度和更长的暴露时间，提示iasⅲ的细胞效应可能是通过其代谢中间产物mmaⅲ间接作用的结果。本研究中，mmaⅲ诱导产生的enosser1179磷酸化能够被抗氧化剂nac有效抑制，提示内皮细胞产生的ros可能在其中发挥作用。进一步应用dcf荧光检测观测到mmaⅲ(075μmol／l)暴露产生的荧光，并且这种荧光也可以被nac预处理所抑制，提示mmaⅲ暴露激活enosser1179磷酸化具有ros依赖性。本研究表明，mmaⅲ暴露能够诱导细胞内产生ros以及ros依赖性enos磷酸化。
(本研究得到中日川医学研究者制度的支持和日本筑波大学熊谷嘉人教授的指导，在此一并表示感谢)
参考文献
〔1〕vaskenaposhianh,zakharyanra,avrammd,woftheenzymologyofarsenicmetabolismandanewpotentialroleofhydrogenperoxideinthedetoxicationofthetrivalentarsenicspecies［j］.toxicolapplpharmacol,2004,198:327-335.
〔2〕souzak,maddockda,zhangq,teactivationofp13k/aktcellsurvivalpathwayismediatedbyp38inculturedhumankeratinocytes［j］.molmed,2001,7:767-772.
〔3〕hossaink,akhandaa,kawamotoy,eactivationisacceleratedbytheinhibitionofarseniteinduced,membraneraftsdependentaktactivation［j］.freeradicbiolmed,2003,34:598-606.
〔4〕kumagaiy,larbasisforarsenicinducedalterationinnitricoxideproductionandoxidativestress:implicationofendothelialdysfunction［j］.toxicolapplpharmcol,2004,198:450-457.
〔5〕mccabetj,fultond,romanlj,edelectronfluxandreducedcalmodulindissociationmayexplain“calciumindependent”enosactivationbyphosphorylation［j］.jbiolchem,2000,275:6123-6128.
(宋艳萍编校)
作者单位：
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